مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

تفکیک و شناسایی باکتری­های تحمل کننده­ فلزات سنگین از مناطق صنعتی و کشاورزی در ماریتیوس

 

چکیده

فلزات سنگین در فرآیندهای متابولیکی Biota نقش مهمی ایفا می­کنند. هرچند آنها به خاطر مصرف زیاد و مواد زاید زیادی که دارند برای انسان­ها و میکروب­ها سمی هستند. باکتری­ها، مکانیسم­های جذب و دفع کسب کرده­اند تا در محیط­های آلوده به فلزات سنگین سازگاری پیدا کنند و پس منبع بالقوه­ای برای فرآیندهای تصفیه زیستی هستند.

باکتری­های انباشته کننده فلزات سنگین را از نمونه­های خاک ماریتیوس جمع آوری کردیم و به وسیله تست بیوشیمیایی استاندارد شناسایی کردیم. از 113 نمونه تفکیک شده، 12 نمونه می­توانستند در حضور مقادیر مختلف جیوه، سرب، نقره، روی و مس رشد کنند و به Bacillales تعلق داشتند که با ژن­های متوالی شده 16SR DNA همه نمونه­ها تأیید شد. دو نمونه 99% با B.Cereus شباهت داشتند و 4 نمونه 98% یا B. Subtilts شباهت داشتند در حالی که بقیه وقتی در ژن بانک شناسایی شدند 91% با گروه B. Subtiltso شباهت داشتند.

 

کلید واژه­ها: فلزات سنگین B. Subtilis و تصفیه زیستی

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه

فلزات سنگین، عبارت کلی­ای است که به گروهی از فلزات و متابولیت­هایی که چگالی اتمی بیشتر از kg 4000 یا 5 برابر آب دارند اطلاق می­شود.

هر چند بعضی از آنها مثل ریز مغذی ضروری برای موجودات عمل می­کنند ولی در غلظت زیاد به شدت سمی هستند. فلزات سنگین در محیط پایدارتر از آلاینده­های ارگانیک مثل آفت کش یا محصولات جانبی نفت هستند و غیر قابل تجزیه هستند. محیط از منابع مردمی مثل غالگر( کوره مخصوص ذوب کردن)، استخراج معدن، ایستگاه­های برق، کود و فاضلاب و زباله­های صنعتی به فلزات سنگین آلوده می­شود. فلزات سنگین بسته به PH خاک و نوع شان در خاک حرکت می­کنند. پس بخشی از جرم فلزات سنگین به آبخیز می­رود و یا در دسترس موجودات زنده قرار می­گیرد. به علاوه فلزات سنگین در سیستم­های بیولوژیکی انباشته می­شوند و سرانجام از طریق مکانیسم­های مختلف وارد شبکه غذا می­شوند. پس آلودگی فلزات سنگین برای اکوسیستم و انسان­ها تهدید ( خطر) جدی به حساب می­آید و هزینه پاک سازی آنها زیاد است.

تکنیک­های فیزیکی و شیمیایی معمولی برای تصفیه( فیلتر استون، اسیدشویی، فرآیندهای الکتروشیمیایی یا تبادل آهن) گران هستند و خیلی مؤثر نیستند.

تصفیه زیستی براساس میکروارگانیسم­ها، گیاهان یا سایر سیستم­های بیولوژیکی روش مقرون به صرفه و بی ضرر محیطی برای پاک سازی فلزات سنگین است. فلزات، فاکتور سمی مهمی برای موجودات موجود در محیط هستند. تحقیقات انجام شده روی تنوع باکتریایی در سایت­های آلوده به فلزات سنگین به تنوع زیاد میکروارگانیسم­ها پی بردند. آنها ارگانیسم­های بومی هستند که نه تنها با محیط­های جدید سازگاری پیدا کرده­اند. بلکه در آن محیط ها رشد کرده­اند. میکروارگانیسم­ها مکانیسم­های زیادی برای پاک سازی غلظت زیاد فلزات سنگین دارند و معمولاً مخصوص یک یا چند فلز هستند.

میکروب­ها مکانیسم­هایی برای تحمل فلزات دارند( با دفع توده سازی یا کاهش یون­های فلزی یا با مصرف آنها به عنوان گیرنده­های الکترون ترمینال در دم زنی ناهوازی). بیشتر مکانیسم­های اعلام شده شامل دفع یون­های فلزی به خارج سلول هستند و ژن مکانیسم­های تحمل در کروموزوم و پلاسمید یافت شده است. باکتری­هایی که به فلزات مقاوم هستند و در حضور آنها رشد می­کنند در بازیافت یون­های فلزی به روش بیوشیمیایی نقش مهمی ایفا می­کنند.

هدف اصلی این تحقیق تفکیک و توصیف باکتری­های انباشته کننده مس، روی، سرب، نقره و جیوه و ارزیابی کاربرد پذیری آنها برای حذف فلزات سنگین از سایت­های آلوده اطراف ماریتیوس است.

 

متریال و متد

جمع آوری نمونه

منطقه تحقیق این مقاله را براساس نیاز، تنوع و میزان آلاینده­های تولید شده توسط صنایع مختلف واقع در ماریتیوس انتخاب کردیم. نمونه­ها را از 4 سایت مختلف جمع آوری کردیم. خاک منطقه دور ریختن زباله و منطقه دور ریختن فلز در روچ بیوس که در مجاورت بندرلیوس واقع شده است، از خاک مناطق کشاورزی شمال جزیره در پودر دور از فلزات بندرگار پورت لیوس. در هر سایت از سه مکان مختلف نمونه برداری کردیم و نمونه­ها را داخل کیسه یا بطری استریل ریختیم و به لابراتوار میکروبیولوژی دانشگاه کشاورزی ماریتیوس منتقل کردیم تا باکتری­ها را تفکیک کنیم.

 

تفکیک باکتری از نمونه­ها

نمونه­ها را به صورت متوالی با آب مقطر رقیق کردیم ( در نمونه خاک تازه و 1ml در نمونه آب شور) تا غلظت نهایی به ^6-10 برسد. 0/1ml از این محلول رقیق را به آگار مغذی منتقل کردیم و در ^oC 37 به مدت 24 ساعت انکوبات کردیم. کشت­های خالص را تفکیک کردیم و دوبار در یک محیط در دمای ^oC 37 کشت کردیم.

 

تست­های بیوشیمیایی:

تست­های بیوشیمیایی زیر را برای شناسایی گونه باکتری­ها انجام دادیم: هیدرولیز نشاسته، تستVP، تست مصرف سیترات، رشد با غلظت7% ، 8%، 1% NACL ، رنگ آمیزی گرم، رشد درC55. کشت‌های خالص را به وسیله طرح­های تاکسونومی وتوصیف تاکسونومی شناسایی کردیم.

 

تحمل فلزات سنگین نمونه­های تفکیک شده

برای بررسی توانایی مقاومت در برابر فلزات سنگین، سلول­ها را یک شب تمام پرورش دادیم و به ظرف آگار مغذی تکمیل شده با غلظت­های متفاوت فلزات سنگین منتقل کردیم ( نقره در سیترات نقره، سرب در استات سرب، جیوه در کلرید مرکوریک 2، روی در سولفات روی، مس در سولفات مس2).

کشت­ها را در ^oC 37 به مدت 24 ساعت انکوبات کردیم و رشد سلول را مشاهده کردیم.

 

 

 

تفکیک DNA ژنومی

DNA توتال را به وسیله پروتکل اصلاح شده مور و همکارانش استخراج کردیم. خلاصه، سلول­های باکتری را به وسیله سانتر یفیوژ در rpm 13000 به مدت 2 دقیقه جمع آوری کردیم.

در بافر Tris- Hcl- EDTA سوسپانسیون درست کردیم و با mg 10 لیزوزیم درC 37 به مدت 30 دقیقه انکوباسیون کردیم. Ml 6 پروتئینازk وml30 SDS 10% اضافه کردیم و مخلوط کردیم و به مدت 1 ساعت در ^oC 37 انکوبات کردیم. برای محلول کافت، ml 100 Nacl اضافه کردیم و در C 65 به مدت 2 دقیقه انکوبات کردیم. سپس ml 80 TAB/Nacl اضافه کردیم و مخلوط را با الکل فنول/ کلروفورم / ایزوآمیل به نسبت 25 : 24 :1 به عمل آوردیم. سوپرناتانت را جمع اوری کردیم و با ایزوپروپانول ته نشین کردیم و در ^oC 20- یک شب تمام نگهداری کردیم. DNA ژنومی را در اتانول 70% شستیم و در ml 100 بافر TE حل کردیم. تصفیه RNASE را برای حذف ذرات RNA باقیمانده در نمونه انجام دادیم. تقویت ژن­های SR DNA 16 به وسیله PCR و آنالیز محصولات PCR : ژن­های SR DNA 16 را با پرایمرهای یونیورسال باکتری برای ژن SR DNA 16 یوباکتریال تقویت کردیم.

PCR حاوی ml 5/0 از هر پرایمر فوروارد و معکوس/ mm 5/1 بافر Tag × 10/ MA 125/0 از هر دئوکسی نوکلئویتد/ 25/1 واحد پلی مراز Taq, DNA وLDNA 5 بود.

شرایط PCR به صورت زیر بوده تقلیب در C 94 به مدت 3 دقیقه/ 30 چرخه تقلیب در ^oC 95 به مدت 1 دقیقه/ تابکاری در ^oC 55 به مدت 1 دقیقه، انبساط در ^oC 72 به مدت 1 دقیقه و انبساط نهایی در
^oC 72 به مدت 10 دقیقه. محصولات PCR را از DNA استخراج شده از نمونه­ها بدست آوردیم و ابتدا با الکتروفورز در ژل اگارز 5/1% آنالیز کردیم سپس با اتیدیوم برومید رنگ آمیزی کردیم و تحت نور VU با طول موج کوتاه مشاهده کردیم.

 

متوالی سازی و همراستایی نوکلئوتید

متوالی سازی SR DNA 16 نمونه تفکیک شده را به وسیله Inqaba Biotec انجام دادیم. توالی­های بدست آمده را با پایگاه اطلاعاتی نوکلئوتید غیر اضافی در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی با استفاده از وب سایت World wide والگوریتم BLAST مقایسه کردیم.

 

 

 

نتایج و بحث

جداسازی باکتری

کلاً 113 باکتری قابل کشت که خصوصیات کلونی اجزایی مثل اندازه، رنگدانه، تاری، بافت، شکل، بالا آمدگی و سطح حاشیه نشان دادند از 4 منطقه برای آنالیز بیو شیمیایی و مولکولی انتخاب کردیم. از بین اینها، 12 باکتری را براساس توانایی رشد در حضور فلزات سنگین برای مطالعه بیشتر انتخاب کردیم (جدول1). نمونه­ها را به وسیله تست­های بیو شیمیایی، توصیف کردیم که طبق راهنمای باکتریولوژی برگی و روش­های مولکولی انجام دادیم.

 

تحمل فلزات سنگین باکتری­های تفکیک شده

همه نمونه ها توانستند انواع فلزات سنگین با غلظت­های مختلف را تحمل کنند. در جدول 2 غلظت فلزات سنگین که باکتری­ها توانستند تحمل کنند را مشاهده می­کنید.

طرح تحمل فلزات سنگین نمونه­های PDA02/ PLW01 مشابه بود یعنی این نمونه­ها از یک نوع هستند. سایر نمونه­ها هم توانستند فلزات سنگین را تحمل کنند. هیچ نمونه­ای نتوانست در حضور غلظت بیشتر از mm3 مس رشد کند. هیچ نمونه­ای نتوانست در حضور غلظت بیشتر از mm 1 جیوه رشد کند. PDA03 تنها نمونه­ای بود که توانست غلظت زیاد فلزات سنگین را تحمل کند.

 

شناسایی باکتری­ها با آنالیزSR DNA 16

با تقویت ژن SR DNA 16 به وسیله PCR ، تکه­هایی به طول bp 750 بدست آوردیم. توالی طول کامل ژن SR DNA 16 10 نمونه را بدست آوردیم که توانستند غلظت بیشتر فلزات را تحمل کنند. توالی­ها را همراستا کردیم و نزدیکترین هماهنگی (اتحاد) را با استفاده از BLAST استخراج کردیم. شناسایی نمونه­ها با تست­های بیو شیمیایی و آنالیز توالی ژن SR DNA 16 نشان داد همه نمونه­ها به Bacillales تعلق دارند. نمونه­های PDA01 وRBM03 تا 99% به B. Cereus شباهت داشتند. نمونه­های PLW02 وRBM01 /RBW01 و RBW03 تا 98% به B. Subtilis شباهت داشتند در حالی که سایر نمونه­ها تا 91% به B. subtlis شباهت داشتند.

 

 

 

 

هدف ما در این تحقیق بدست آوردن کلکسیون باکتری­هایی بود که توانستند غلظت زیاد فلزات سنگین را تحمل کنند تا بعداً از آنها در توسعه مایه تلقیح خاک میکروبی برای اهداف زیست تقویت استفاده کنیم.

باکتری­ها را با استفاده از روش­های بیولوژیکی مولکولی مستقل از کشت و میکروبیولوژی معمولی شناسایی کردیم. به علاوه، نمونه­هایی تحمل کننده فلزات سنگین را شناسایی کردیم. نتایج شناسایی نشان دادند تعداد نماینده­های نمونه با سیلوس در نمونه­های آلوده بیشتر است. با ترکیب تست­های بیو شیمیایی و آنالیز ژنتیک توانستیم دو نمونه­ای شناسایی کنیم که 99% به B.Cereus شباهت داشتند.

B.subtilis تا97% - 98% شباهت توالی داشتند و بقیه 91% شباهت داشتند. جنس با سیلوس در محیط‌های خاکی و آب شیرین فراوان است و در محیط پراکندگی وسیعی دارد پس در همه سایت­های تحقیق حاضر بود.

این پدیده طبق نتایج چند تحقیق است که به فراوانی زیاد B.acillales در خاک­های آلوده به فلزات سنگین اشاره کردند.

بیشتر نمونه­ها توانستند در حضور غلظت بیشتر Ag رشد کنند ولی PDA01 توانست غلظت Ag⁺ 1mm را تحمل کند. هر چند نمونه­ها در mm 5 به صورت کلونی­های کوچک رشد کردند وطرح رشدشان از طرح رشد نمونه­های کشت شده در mm 5/0وmm 1 وmm 3 متفاوت بود. اثر مهارکنندگی غلظت­های بیشتر Ag⁺ برای بعضی نمونه­ها به خاطر پیوند سطحی و تخریب عملکرد غشاء بود. مکانیسم مقاومت به سرب به خاطر برون ریز سرب به وسیله P-type ATPASE و توده شده ترکیبات درون سلولی است. هیچ کدام از نمونه­ها نتواستند غلظت بیشتر از Hg⁺1mm را تحمل کنند. مقاومت به Hg⁺ به خاطر اپرون­های mer است که از ژن­های کدگذار پروتئین­های عملکردی مثل پروتئین­های ناظرmerR انتقال merT و merP و کاهش merA تشکیل شده­اند.

یک سری خانواده پروتئین، پروتئین­های انتقال و آنزیم­های کدگذاری شده به وسیله اپرون mer در سم زدایی یون جیوه نقش دارند. برای مقاومت بخشیدن به خیلی از organo- mercurials ها به ژن­های merB بیشتری نیاز است. محصولات ژن mer از مسمومیت یون جیوه جلوگیری می­کنند. در حقیقت، معلوم شده خیلی از ژن­های تأثیر پذیرفته از فشار فلزات به وسیله پروتئین­های ناظر فلز مثل

CueR ,ArsR,PerR, MutR, Fur کنترل می­شوند. چند گونه باکتری از مکانیسم­های پیوند درون و برون سلولی برای اجتناب از مسمومیت به pb⁺² استفاده می­کنند. مثلاً B. subtilis ظرفیت جذب زیادی برای pb⁺² دارد.

سایر مکانیسم­ها شامل بدون ریز یون­های سرب و پنهان کردن یون­های سرب هستند. غلظت مهار کنندگی cu⁺² برای همه نمونه­ها mm 5 بود. بیشتر نمونه­ها توانستند در محیط حاوی mm3 یون مس رشد کنند در حالی که تحمل B. subtilis به مس خیلی کم بود. تحمل مس به خاطر این است که B.subtilis می­تواند یون­های مس را در دیواره سلول خود انباشته کند و از ورود آنها به سلول جلوگیری کند. هرچند غلظت بیشتر مس موجب اکسیداسیون غشای لیپید، آسیب به اسید نوکلئیک و تولید رادیکال­های آزاد از پروکسید هیدروژن می­شود. فقط یک نمونه به نام (PDA03)B. subtilis جدا شده از مناطق کشاورزی توانست غلظت زیاد فلزات سنگین مختلف استفاده شده در این آزمایش را تحمل کند که احتمالاً به خاطر حفاظت در برابر استرس اکسیداتیو و پمپ­های برون ریز متعدد بود.

 

خاتمه

ما در این مقاله وجود باکتری­های تحمل کننده فلزات سنگین در نمونه­های خاک و آب شیرین سایت‌های آلوده به فلزات سنگین منطقه ماریتیوس را بررس کردیم.

باکتری­های تحمل کننده فلزات سنگین را از کشت­های خالص جدا کردیم. همه آنها به Bacillals تعلق داشتند. خلاصه نتایج ما نشان دادند 12 نمونه، مخصوصاً نمونه PDA03 غلظت زیاد فلزات سنگین را تحمل می­کنند پس می­توانند در زیست تقویت سایت­های صنعتی و کشاورزی آلوده به فلزات سنگین به کار روند. از ظرفیت ژنتیکی باکتری­ها می­توان برای تصفیه آلودگی فلزات سنگین استفاده کرد.

اصلاح ژنتیکی به توسعه روش­هایی برای فرآیندهای آلودگی زدایی کمک می­کند. با این وجود متوالی سازی ژنوم میکروارگانیسم­ها و مصرف omic هایی مثل ژنومیک، پروتئومیک، متابولیک و غیره ما را به مسیرهای متابولیکی شناسایی ژن­ها، پروتئین­ها و متابولیت­هایی که در تحمل فلزات سنگین نقش دارند می­رساند.

http://daneshjooqom.4kia.ir/