مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

گزارش کار جلسه‌ی اول هماتولوژی عملی1

عنوان: اصول خون گیری و ضد انعقادها

اعضای گروه: مریم دهدشتی- معصومه نوروزی

استاد: جناب آقای دکتر حمید سماک

ترم: دوم 89-88

تهیه کننده: دهدشتی

 

گزارش کار جلسه‌ی اول آزمایشگاه خون شناسی

تئوری آزمایش

چندین علت برای درخواست آزمایش توسط پزشک وجود دارد که مهمترین آنها عبارتند از:

1. اثبات صحت تشخیص بیماری

2. کمک به تشخیص صحیح

3. کنار گذاشتن یک و یا چند تشخیص احتمالی

4. تنظیم یک پروتکل درمانی صحیح و تعیین روند آن

5. تعیین پیش آگهی بیماری

6. تأیید بهبودی بیمار

7. جستجوگری و بیماریابی در جامعه (آزمایش P.P.D و یا تست مانتو)

8. پیشگیری از بروز بیماری در آینده و...

داده‌های آزمایشگاه زمانی برای پزشک مورد استفاده است که از صحت (نزدیک بودن ارزش بدست آمده در اندازه‌گیری یک ماده نسبت به ارزش واقعی آن) و دقت کافی برخوردار باشد که این میسر نمی‌شود مگر:

1. داشتن دانش کافی آزمایش کننده و درک اهمیت کاری که انجام می‌دهد.

2. صحت و دقت وسائل کار، سالم بودن محلول‌ها و مواد مصرفی

3. نمونه گیری صحیح، نظم در حمل و نقل، تقسیم صحیح نمونه، آزمایش دقیق و گزارش کار صحیح نتایج

 

مشخصات برگه آزمایش

برگه آزمایش باید شامل مشخصات کامل بیمار، نام و نام خانوادگی، سن، جنس، بخش، تاریخ بستری شدن، تاریخ درخواست آزمایش، شماره بیمارستان، شماره اتاق یا تخت، نام پزشک معالج و تشخیص احتمالی باشد. معمولاً این مشخصات در دفتر آزمایشگاه ثبت شده، شماره آزمایشگاه در زیر برگه درخواست قید و برگه به قسمت نمونه گیری ارسال می‌شود بهتر است جهت جوابگویی در مواقع نیاز، ساعت و تاریخ ورود برگه درخواست در زیر آن قید شود.

 

نمونه گیری خون از بیماران

هر چند پاره‌ای از آزمایشات نیاز به ناشتا بودن بیمار داشته و عده‌ای ندارند ولی از آنجایی که مقادیر بدست آمده را باید جهت تفسیر با اعداد نرمالی مقایسه کنیم که جهت تنظیم آنها در صبح ناشتا از افراد سالم نمونه گیری به عمل آمده، بهترین زمان نمونه گیری، اول صبح و قبل از خروج بیماران از رخت‌خواب (در مورد بیماران بستری) می‌باشد.

فی المثل از آنجایی که در اثر پیاده روی، دویدن و ورزش، احتمال مشاهده‌ی Pro و Hb در ادرار افزایش می‌یابد. هر چند اندازه گیری بعضی از پارامترهای خون همچون Hb و HCT نیاز به مقدار خون زیادی ندارند بعضی دیگر مانند آزمایشات بیوشیمیایی مقدار نمونه‌ی بیشتری را طلب می‌کنند.

 

جهت گرفتن خون از بیمار 3 راه کلی وجود دارد:

1. سوراخ کردن پوست (سوراخ کردن مویرگ): جهت آزمایشاتی که به مقدار خون کمی نیاز دارند.

2. سوراخ کردن ورید: جهت آزمایشاتی صورت می‌گیرد که مانند آزمایشات بیوشیمیایی به مقدار بیشتری خون احتیاج باشد.

3. سوراخ کردن شریان: در مواقع اجبار (نمونه گیری از ورید بيمار مشكل باشد) و يا جهت آزمايشات خاصي مانند گازهاي خون صورت مي‌پذيرد.

در هر حالت فوق تمام وسايلي كه براي نمونه گيري بكار مي‌روند مانند سوزن، سرنگ، پنبه، گاز، لانست و سواپ بايد استريل باشند.

نتايج آزمايشات صورت گرفته بر روي خون‌هاي سرخرگي (شرياني) مويرگي و سياهرگي (وريدي) با يكديگر تفاوت دارند چرا كه خون اكسيژن‌داري كه از ريتين به قلب وارد شده و توسط آن به ارگان‌ها و بافت‌هاي گوناگون پمپ مي‌شود از نظر تركيبات خون سياهرگي بسته به فعاليت متابوليكي عضو در اعضا مختلف متفاوت است. بنابراين محل نمونه گيري خون‌هاي مويرگي و سياهرگي مهم و در نتايج آزمايشات بي‌تأثير نمي‌باشد. آنچه مسلم است خون سياهرگي از نظر ميزان اكسيژن، PH، گاز كربونيك، گلوكز، اسيدلاكتيك، يون كلر، غلظت آمونياك، سطح داروها، درصد هماتوكريت و تعداد يا درصد لنفوسيت‌ها با خون سرخرگي تفاوت دارد.

در نمونه گيري بوسيله‌ي سوراخ كردن پوست از آنجايي كه در واقع مويرگ را پاره مي‌نماييم خون بدست آمده مخلوطي از دو خون سرخرگي و سياهرگي مي‌باشد. هر چند كه مقداري از مايع بين سلولي نيز وارد آن خواهد شد.

در هر كدام از سه طريقه نمونه گيري ذكر شده نياز است ابتدا پوست محل نمونه گيري استريل شود كه جهت اين امر در آزمايشگاه‌ها عمدتاً از الكل استفاده مي‌شود.

 

مكانيسم اثر الكل‌ها

هر چند غلظت‌هاي بالاي هر ماده‌ي آلي با ساختمان شيميايي R-CH₂oH مي‌تواند براي باكتري‌ها كشنده باشد و موجب نابودي آنها گردد ولي بايد توجه داشت كه هر نوع الكل در غلظت خاصي از حداكثر فعاليت خود برخوردار مي‌باشد. براي مثال اتيل و ايزوپروپيل الكل كه معمولاً استفاده مي‌گردند در غلظت 70% محلول آبي از حداكثر توان باكتري كُشي خود برخوردار هستند در حالي كه الكل‌هاي متيليك و پروپيليك در غلظت 100% نهايت اثر سمي خود را آشكار مي‌سازند.

توجه داشته باشيم كه هر چند مكانيسم اثر الكل‌ها به هم ريختن شكل فضايي (دناتوره كرون) پروتئين سلول‌ها من جمله باكتري‌ها است ولي اين اثر نياز به زماني حدود 2 دقيقه دارد بنابراين مكانيسم پاك نمودن پوست محل نمونه گيري، عملي مكانيكي است كه با كشيده شدن پنبه الكلي در غلظت مناسب بر روي پوست صورت مي‌گيرد. بدين ترتيب كه بوسيله پنبه الكل همراه با چربي‌ها و گرد و غبار روي پوست باكتري‌ها نيز برداشت شده و به پنبه متصل مي‌شوند. بنابراين چون زمان كشيده شدن پنبه الكلي بر روي پوست 2 دقيقه طول نكشيده و از طرفي الكل مصرفي نيز از سطح پوست تبخير مي‌شود يا هيچ گاه محل نمونه گيري استريل نمي‌شود به همين علت دقت نماييد كه با كشيدن پنبه الكل به مدت مناسب و فشار كافي (ولي نه زياد) حتي الامكان از تعداد باكتري‌هاي سطح پوست كم نماييد.

الكل‌ها قادر به از بين بردن اكثر ويروس‌ها نمي‌باشند ولي از آنجايي كه ويروس‌ها زندگي اجباري درون سلولي دارند بصورت نرمال در روي پوست وجود نداشته و از اين بابت خطري بيمار را تهديد نمي‌كند.

 

نحوه‌ي نمونه گيري از خون مويرگي

به ترتيب زير عمل مي‌شود:

1. انگشت سوم يا چهارم را جهت نمونه گيري انتخاب نماييد.

2. به كمك پنبه آغشته به الكل 70% تا حد ممكن باكتري‌هاي سطح پوست را كاهش دهيد.

3. به كمك گاز استريل سطح پوست را خشك كنيد.

4. به كمك لانست تيز، استريل و يكبار مصرف با يك ضربه سريع پوست را سوراخ نماييد.

5. به علت وجود مايع بين سلولي زياد در قطره‌ي اول، آن را با گاز استريل از سطح پوست برداشت كنيد.

6. قطرات بعدي را بدون فشار دادن انگشت يا ماساژ آن برداشت نماييد، چرا كه ماساژ زياد موجب ورود مايع بين سلولي به داخل خون و در نتيجه رقت آن مي‌شود.

7. اگر در اثر انقباض مويرگ‌هاي محيطي (مثلاً در اثر سرما يا كم خوني شديد) گرفتن نمونه مشكل است، گرم نمودن دست بيمار مثلاً با آب ولرم جهت افزايش جريان خون انگشت توصيه مي‌شود.

8. خون معمولاً بوسيله پيپت و يا لوله‌هاي موئين جمع آوري مي‌شود.

9. معمولاً چون چنين خوني جهت آزمايشات خون شناسي بكار مي‌رود لوله يا پيپت موئين بايد آغشته به ماده‌ي ضد انعقاد باشد.

هر چند اين شكل نمونه گيري بعلت سهولت آن طريقه‌ي مناسبي بخصوص جهت تهيه‌ي اسمير خون محيطي و مشاهده شكل مرفولوژي سلول‌ها بوده و نتيجه شمارش سلول‌ها بوده و نتيجه شمارش پلاكت‌ها نيز به اين طريق به عقيده‌ي بعضي از محققين بهتر از ديگران طرق نمونه‌گيري است ولي به دلايل زير نمي‌توان از اين روش در همه موارد استفاده نمود:

1. مقدار نمونه بدست آمده جهت بسياري از آزمايشات بيوشيمي ناچيز مي‌باشد.

2. به علت مقدار كم نمونه تكرار آزمايشات مقدور نمي‌باشد.

3. احتمال تخريب پاره‌اي از گلبول‌هاي قرمز (هموليز) وجود دارد.

4. نمونه‌گيري وقت‌گير است.

5. نتايج بدست آمده با نتايج خون وريدي تفاوت داشته و استانداردهاي نرمال بر مبناي خون سياهرگي مي‌باشد.

6. كم كردن تعداد باكتري‌هاي سطح پوست انگشتان به علت وجود ناخن مشكل‌تر بوده و اين امر در مورد بيماراني كه ضعف سيستم ايمني دارند حياتي است (جهت كم شدن تعداد باكتري‌هاي نوك انگشتان نياز به 8 تا 10 دقيقه تماس پوست با غلظت مناسب الكل مي‌باشد).

بنابراين چندان از اين روش خصوصاً در مورد بيماران مبتلا به انواع اوليه و يا اكتسابي ضعف ايمني نبايد استفاده نمود.

چون نمونه گيري وريدي و يا شرياني از نوزادان و كودكان زير يك سال بسيار مشكل است معمولاً نمونه گيري از آنها بوسيله‌ي سوراخ كردن پوست پاشنه پا (خون مويرگي) صورت مي‌پذيرد.

جهت آزمايش از نوزادان امروزه روش‌هايي تدارك ديده شده كه نياز به خون زيادي نداشته باشند مثل بيلي روبين، كلسيم، گلوكز و G₆PD.

 

نحوه‌ي نمونه گيري از وريد

معمولاً از 3 وريد موجود در روي ساعت و در ناحيه پشت آرنج (Antecubital fassa) استفاده مي‌شود كه عبارتند از:

1. وريد سفاليك

2. وريد مديال

3. وريد بازيليك

در مواردي كه اين 3 وريد مشخص نباشند مانند چاقي مفرط بيمار معمولاً از وريدهاي سطحي ديگري مانند پشت دست، پشت پا، قوزك پا، وريد فمورال و حتي وريدهاي وداج خارجي استفاده مي‌شود.

جهت مشخص كردن سياهرگ‌ها سعي مي‌شود يا وسيله‌اي مجراي وريد را مسدود نمايند بطوري كه خون در پشت آن اجتماع يابد. اين وسيله عمدتاً گاروياتورنيكت نام دارد. هر چند كه مي‌توان از كيسه‌ي فشارخون نيز استفاده نمود. مكانيسم عمل آنها بدين شكل است كه با بستن گارو بعلت آنكه اولاً وريدها سطحي بوده و فشار زيادي بر آنها وارد مي‌آيد و ثانياً فشارخون در وريد بسيار كمتر از شريان است جريان خون در وريدها قطع مي‌شود ولي به دليل آنكه:

1. شريان‌ها عمقي بوده و فشار زيادي توسط گارو بر روي آنها وارد نمي‌آيد.

2. فشارخون در شريان‌ها بسيار بيشتر از وريدهاست.

جريان خون در شريان‌ها قطع نمي‌شود.

بنابراين ماحصل بستن گارو، تجمع خون در پشت آن و تورم وريد است كه موجب سهولت نمونه گيري مي‌شود.

براي بسياري از آزمايشات، نمونه گيري وريدي بعد از تورم آن و بدون باز نمودن گارو خطايي را موجب نمي‌شود ولي به علت فشار وارده بر سلول‌هاي جداره وريد و عضلات توسط گارو و وارد شدن مايع بين سلولي بداخل وريدها و همچنين نيز سلول‌هاي قرمز خون، اولاً نبايد مدت زيادي گارو بر روي دست بيمار بسته باقي بماند و ثانياً به علل وارد شدن، يعني بين سلولي به داخل جريان خون و يا بالعكس، خروج پلاسما از وريد و تغليظ خون و وارد شدن كلسيم و پتاسيم درون سلول‌هاي جداره وريد، عضلات و سلول‌هاي خوني بداخل پلاسما و ورود سديم از پلاسما به داخل سلول‌هاي فوق الذكر و بالاخره نشت فاكتور سنجي انعقادي (فاكتور سه Tissue factor) از سلول‌هاي عضلات و جداره عروق به خون اصولاً بستن گارو محكمتر از حد لازم و يا به مدت طولاني نه تنها موجب خطا در آزمايشات مي‌شود بلكه موجب اذيت و آزار بيمار نيز مي‌گردد. به هر حال جهت ممانعت از بازگشت خون به قلب از هر نقطه كه نمونه‌گيري به عمل مي‌آوريد بايد گارو را بالاتر از آنجا (حدود 5 الي 10 سانتي متر) ببنديد.

محل نمونه گيري را با پنبه آغشته به غلظت مناسبي از الكل، حتي المقدور عاري از ميكروب نماييد (كشيدن پنبه الكلي در روي وريد بهتر است حلقه‌وار و از مركز به محيط صورت پذيرد) سپس با يك گاز استريل محل را خشك كنيد. وريد موردنظر را از قبل تعيين نموده و سعي كنيد مستقيماً با سوزن وارد آن شويد.

توجه داشته باشد جستجوي وريد با سوزن نه تنها به علت اينكه گارو بر روي دست بيمار بسته است موجب خطا در آزمايش و بخصوص تخريب RBCها (هموليز) نمونه مي‌شود بلكه براي بيمار نيز دردناك است. همچنين توجه داشته باشيد درد مانند ديگر استرس‌ها موجب ترشح زياد هورمون‌هاي استروئيدي و كاتكولآميني كشته و بدون شك بر روي نتايج آزمايشات اثر سوء خواهد گذاشت.

مجراي سوزن بايد بطرف بالا باشد و توجه كنيد كه زاويه سرنگ با دست بيمار حدود 30 درجه باشد چرا كه زاويه كمتر موجب چسبيدن مجراي سوزن به جداره وريد و در نتيجه انسداد آن مي‌شود.

اندازه و قطر سوزن بايد مناسب نمونه گيري باشد چرا كه سوزن‌هاي نازك موجب طولاني شدن زمان نمونه گيري، لخته شدن خون درون سرنگ و هموليز گشته و در عين حال نمونه گيري با سوزن‌هاي كلفت نيز براي بيمار دردناك است.

بعد از گرفتن مقدار خون كافي اگر كارو هنوز بسته است ابتدا آن را باز كنيد. پنبه الكل را روي محل سوزن گذاشته و به آرامي آن را از درون رگ بيرون بكشيد. قبل از لخته شدن خون در سرنگ بايد به سرعت سوزن را دور انداخته و خون را درون لوله‌هاي مربوط تقسيم نماييد.

در رابطه با آزمايشات خون شناسي و انعقادي عمدتاً از مواد ضد انعقادي جهت ممانعت از ايجاد لخته شدن استفاده مي‌شود در حالي كه اكثر قريب به اتفاق آزمايشات سرم شناسي و بيوشيمي بر روي سرم صورت پذيرفته و در نتيجه نياز به افزودن مواد ضد انعقاد به لوله‌هاي مربوطه نمي‌باشد.

مخلوط شدن خون با ماده‌ي ضد انعقاد بايد به آرامي و بوسيله‌ي پشت و رو كردن شيشه درپوش‌دار مربوطه صورت پذيرد. توجه داشته باشيد كه در صورت جدا نشدن سرنگ از سوزن و تقسيم خون داخل لوله‌ها بوسيله‌ي سرنگ سوزن‌دار تخريب ياخته‌هاي سرخ و هموليز حتمي است. از طرف ديگر در موقع ريختن خون به داخل لوله‌ها بايد از تميز و خشك بودن لوله‌ها مطمئن بود.

قبل از اقدام به نمونه گيري بايد لوله‌هايي كه قرار است نمونه در آنها تقسيم شود همگي برچسب خورده و نام بيمار و مشخصات وي بطور خوانا روي آن قيد شده باشد.

بعد از تقسيم نمونه گاز استريلي را بايد بر روي دست بيمار در محل نمونه گيري گذاشته و از وي بخواهيم با دست ديگرش محل زخم را كمي فشار دهد و يا اگر نمونه گيري از ساعد به عمل آمده بيمار دستش را خم نمايد.

هر چند بستن گارو و زدن الكل موجب نمايان شدن بهتر وريد مي‌گردد ولي گاهي اين مهم بوسيله‌ي مشت كردن بيمار (در صورت نمونه گيري از ساعد) كامل مي‌شود. چرا كه با مشت كردن عضلات ساعد منقبض و وريدها بيرون مي‌زنند. در اين صورت بعد از باز كردن گارو و قبل از بيرون كشيدن سوزن بيمار بايد مشت خود را باز كند.

از آنجايي كه احتمال شوكه شدن بيماران وجود دارد بهتر است تا بند آمدن خون، بيمار از محل نمونه گيري حركت ننمايد. گاهي بيماران به علل مختلف مانند ديدن خون، گرسنگي بيش از حد و تحريك شدن اعصاب پاراسمپاتيك شوكه گشته و از صندلي به زمين مي‌افتند در اين صورت:

1. خونسردي خود را حفظ كنيد.

2. سعي كنيد از اصابت سر بيمار به نقاط تيز و خطرناك جلوگيري نماييد.

3. بيمار را بر روي تخت و يا كف اتاق خوابانده و پاهاي وي را بالاتر از سطح بدنش بگيريد تا جريان خون به مغز وي تسريع گردد.

4. با حرف زدن، سيلي زدن و پاشيدن آب سرد بر روي صورتش اعصاب محيطي وي را تحريك كنيد.

5. مواظب باشيد زبان وي در بين دندان‌هايش قرار نگرفته باشد.

6. با سؤال و پرسش از وي سعي در به فكر انداختن او نماييد.

از فوايد خون گيري وريدي، بدست آوردن نمونه به مقدار زياد است بطوري كه جهت آزمايشات شيمي، سرولوژي و خون شناسي معمولاً كفايت داشته و در صورت تكرار آزمايشات نيز نياز به نمونه گيري مجدد نمي‌باشد. در صورتي كه از وريدهاي مختلف يك عضو نمونه گيري شود نتايج با يكديگر فرق چنداني نخواهد داشت. استانداردهاي نرمال را از نمونه‌هاي وريدي تعيين نموده‌اند.

در صورتي كه قادر به انجام آزمايشي در آن روز بر روي نمونه سرم يا پلاسما نيستيم، مي‌توانيم نمونه را با منجمد ساختن، نگهداري نماييم مگر در مواردي كه حتي انجماد قادر به نگهداري ماده نباشد (آنزيم اسيد فسفاتاز) با اضافه كردن ماده ضد انعقاد EDTA به خون و ممانعت از ايجاد لخته مي‌توان آزمايشات مختلف خون شناسي من جمله شمارش و فعاليت پلاكت‌ها را انجام داد. در صورتي كه منظور از اضافه نمودن ماده ضد انعقاد بدست آوردن پلاسما جهت آزمايشات بيوشيمي باشد هپارين (Heparin) ارجح‌تر از بقيه مي‌باشد.

نكته‌ي منفي در نمونه گيري از وريد، طولاني شدن مدت خون گيري و بسته بودن گارو است. چرا كه علاوه بر خطاهاي فوق الذكر در آزمايشات بيوشيمي، به علت تغليظ خون، آزمايشات خون شناسي را نيز با اشكال مواجه مي‌سازد.

بعضي از اجزا و مشتقات خون پايدار نمي‌باشند چرا كه براي مثال در رابطه با آزمايشات خون شناسي هر چند ماده ضد انعقاد افزوده مي‌شود ولي خود اين ماده مي‌تواند موجب اثر سوء گردد. لذا شمارش پلاكت‌ها آزمايش ميزان رسوب گلبولي يا سديمانتاسيون و آزمايشات انعقادي بايد حداكثر در عرض مدت 2 ساعت بعد از نمونه گيري صورت پذيرد.

توجه داشته باشيد اگر به وريد بيماري سرم‌هاي تزريي (سرم قندي نمكي- قندي- نمكي)، خون، پلاسما و يا هر داروي ديگري متصل است، بزرگترين اشتباه نمونه گير، گرفتن خون از همان وريد است. چرا كه نه تنها موجب اشتباه فاحش و فاجعه‌باري در آزمايشات بيوشيمي مي‌گردد بلكه بدليل رقيق شدن خون، نتايج آزمايشات خون شناسي نيز فاقد ارزش بوده و در اين موارد بايد از دست ديگر بيمار نمونه گيري به عمل آيد.

 

نحوه‌ي نمونه گيري از شريان

پاره‌اي از آزمايشات (مانند آزمايش‌هاي گازهاي خون (Blood Gas) نياز به نمونه گيري شرياني دارند. از طرف ديگر ممكن است چنان نمونه گيري وريدي مشكل باشد (بيماران شوكه) كه نمونه گير مجبور شود خون شرياني را جهت آزمايشات به آزمايشگاه ارسال نمايد. لذا، لازم است افرادي كه مسئوليت گرفتن نمونه‌ها را تقبل مي‌نمايند. در گرفتن خون شرياني نيز مهارت لازم را داشته باشند.

معمولاً از شريان‌هاي مچ دست، ساعد و فمورال جهت نمونه گيري استفاده مي‌گردد. ولي از آنجايي كه احتمال خونريزي از محل نمونه گيري (بعلت فشار بالاي خون شرياني) بعد از بند آمدن اوليه خون وجود دارد. نمونه گيري از محلي كه در ديد كادر پرستاري باشد ارجح بوده و مچ دست محل مناسبتري محسوب مي‌شود. براي نمونه گيري از شريان بعد از احساس ضربان شريان با انگشت اشاره محل را با پنبه آغشته به الكل تا حدي عاري از باكتري نماييد.

انگشت‌هاي اشاره و سوم را در دو طرف محل مورد نظر قرار دهيد بطوري كه ضربان را بوسيله‌ي هر دو انگشت حس كنيد. كمي پيستون سرنگ را به عقب بكشيد سپس سوزن را بطور قائم در بين دو انگشت خود به آرامي وارد كرده و به آهستگي پايين ببريد. چون خون شرياني داراي فشار است هنگامي كه وارد شريان شديد خون از سوزن بالا آمده و در قسمتي از سرنگ كه پيستون آن را قبلاً عقب كشيده‌ايد وارد مي‌شود بطوري كه شما آن را مشاهده خواهيد نمود. به علت فشار شرياني، نياز به كشيدن شديد پيستون به عقب نداريد به آرامي اين عمل را انجام دهيد خون شرياني به علت داشتن اكسيژن در حالت معمول رنگ قرمز روشني دارد مگر آنكه عمل ورود اكسيژن از ريتين به خون با مشكلي مواجه بوده و يا آنكه Hb بيمار غيرطبيعي باشد كه در اين صورت انتهاي اندام‌هاي وي (انگشتان دست و پا و لب‌ها) نيز سيانوزه خواهد بود. بعد از نمونه گيري و قبل از بيرون آوردن سوزن گاز استريلي را در محل سوزن گذاشته و سپس آن را بيرون بكشيد. فشار بر روي گاز بايد بيشتر از نمونه گيري وريدي و مدت آن طولاني‌تر باشد.

 

ضد انعقادها (Anticoagulants)

اثرات ضد انعقادها بر روي مورفولوژي سلول‌هاي خوني: اگر خون حاوي ماده ضد انعقادي را قبل از تهيه‌ي گسترش (اسمير) از آن، در آزمايشگاه رها نماييم. تغييرات دژنراتيو در آن ايجاد مي‌شود. اين تغييرات صرفاً به دليل وجود مواد ضد انعقادي نمي‌باشد، چرا كه در خون‌هايي كه دفيبرينه شده هم اين تغييرات رخ خواهد داد. صرف نظر از مواد ضد انعقادي اسميري كه از خون يك ساعت مانده تهيه كرده باشند را نمي‌توان از اسمير خون تازه بدرستي تفكيك كرد، چرا كه اين دو تفاوت چنداني با يكديگر ندارند. ولي بعد از 3 ساعت كه از ماندن خون گذشت تغييرات شروع شده و بعد از h18-12 تخريب سلولي آغاز مي‌شود. في المثل با ماندن خون، تعدادي از نوتروفيل‌ها تحت تأثير قرار گرفته و هسته‌ي آنها نسبت به سلول‌هاي تازه به صورت يكنواخت‌تري رنگ مي‌پذيرند.

لب‌هاي (سگمنت‌ها) هسته آنها ممكن است از يكديگر جدا شده، حاشيه‌ي سيتوپلاسم بصورت مضرس در آمده و يا اينكه واضح و روشن ديده نشود. همچنين حفرات كوچكي نيز در سيتوپلاسم آنها ايجاد مي‌شود. مونوسيت‌ها نيز دستخوش تغييراتي مي‌شوند. مثلاً در سيتوپلاسم آنها حفرات كوچكي نيز ديده شده و يا اينكه هسته سلول تحت فشار زياد شروع به خرد شدن مي‌كند. لنفوسيت‌ها نيز متحمل تغييرات مختلفي مي‌شوند في المثل ذراتي در سيتوپلاسم آنها پديدار شده و يا هسته‌شان شروع به جوانه زدن كرده و در نهايت بصورت دو يا سه لبه در مي‌آيند. حتي ممكن است هسته‌هاي لنفوسيت‌ها نسبت به مواقع طبيعي به شكل يكنواخت‌تري در مي‌آيند. همچنين RBCهاي افراد نرمال نيز بعد از مدت 6 ساعت تحت تأثير قرار گرفته (در حرارت ^oC25-18) و گذشت زمان باعث كنگره‌دار شدن و كروي گشتن آنها مي‌شود.

خوني كه دفيبرينه شده است هم به اندازه خون داراي EDTA دچار تغييرات مي‌گردد. اگر خون را پس از گرفتن از بيمار در حرارت ^oC4 قرار دهيم تمام تغييرات ذكر شده به تعويق خواهد افتاد. مسائلي كه ذكر شد همگي دليل بر اين مدعا است كه هر چند ترجيحاً بايد بلافاصله بعد از گرفتن خون، اسمير تهيه گردد اما تغيير و تعلل تا 1 الي 3 ساعت هم قابل چشم پوشي مي‌باشد.

بخصوص در موارد مسموميت با سرب، تهيه لام قبل از افزودن ماده ضد انعقاد قابل ستايش است چرا كه گرانول‌هاي درون يافته‌ي سرخ پس از مخلوط شدن خون با ضد انعقاد چندان خوب رنگ نخواهد گرفت. در اسميرهايي كه از خون تازه (بدون ماده ضد انعقاد) تهيه شده‌اند، تجمع پلاكتي مشاهده گشته و به همين دليل اين گونه لام‌ها براي كنترل شمارش پلاكت‌ها و يا تخمين تعداد آنها مناسب نمي‌باشند. ولي با اين وجود اين لام‌ها براي تشخيص بيماران مبتلا قبلاً به نوعي پورپورا، از ارزش خاصي برخوردار هستند چرا كه در اكثر موارد عدم وجود تجمع پلاكتي در اسمير خون بدون ضد انعقاد، نشانه‌ي خوبي براي تشخيص اين نوع بيماري است.

پورپورا عارضه‌اي است كه با پيدايش لكه‌هاي ارغواني بر روي پوست و مخاط‌ها مشخص مي‌شود.

 

طرز عملكردي مواد ضد انعقادي

EDTA و سيترات سديم، كلسيم يونيزه را كه لازمه انعقاد خون است، از محيط حذف كرده و آن را بصورت غيرمحلول و يا غير يونيزه در مي‌آورند.

هپارين به طريق ديگري عمل كرده، با آنتي ترومبينIII بصورت كوفاكتور تركيب شده و از انعقاد جلوگيري كرده. سيترات سديم و هپارين را مي‌توان بعنوان ضد انعقاد مناسب در انتقال خون هم بكار برد. براي نگهداري گلبول‌هاي سرخ به مدتي طولاني‌تر، براي آزمايشات خاص و يا انتقال خون از سيترات به شكل ACD (اسيد- سيترات- دكستروز) يا CPD (سيترات- فسفات- دكستروز) و يا محلول Alsever استفاده مي‌شود.

 

تغييرات كمي ايجاد شده در اثر ماندن خون

بدون توجه به نوع ضد انعقاد مصرفي اگر خون را در محيط خارج و دماي 25-18 درجه سانتي‌گراد قرار دهيم، تغييرات واضحي در آن ايجاد مي‌شود. هر چند كه اين تغييرات در خون‌هاي مخلوط شده با محلول‌هاي ACD و CPD و يا Alsever نسبت به خون داراي EDTA كمتر خواهد بود. في المثل با گذشت زمان RBCها شروع به متورم شدن نموده و ميزان MCV بطور كاذب بالا مي‌رود. شكنندگي اسمزي و زمان PT (پروترومبين) به آرامي افزايش يافته و ميزان ESR كاهش مي‌يابد.

شمارش WBC و پلاكت‌ها تدريجاً پايين مي‌آيد. اگر خون را در طي شب در دماي 4 درجه سانتي‌گراد قرار دهيم تغييرات قابل توجهي در ميزان MCV ايجاد نشده و تغييرات ديگر نيز با اين شرايط كمتر ديده مي‌شوند. بنابراين به دلايل متعدد ذكر شده خون را بايد در طي شب در يخچال نگهداري كرد به شرط آنكه يخ نزند.

شمارش ريتكولوسيت پس از 6 ساعت ماندن خون در آزمايشگاه كاهش يافته و ضمناً پس از يك يا دو روز ماندن خون، گلبول‌هاي قرمز هسته‌دار (NRBC) بالغ گشته و از خون ناپديد مي‌شوند. بنابراين مشاهده مي‌شود كه چرا در تمام كتب تهيه هر چه زودتر اسميرها بارها مورد تأكيد قرار مي‌گيرد هر چند كه به شرط آلوده نشدن خون قبل از انجام آزمايش هميشه بايد مورد تأكيد قرار بگيرد. اگر خون سرد است ابتدا بايد در حرارت اتاق گرم و سپس به خوبي مخلوط گردد.

در اينجا چند ضد انعقاد را معرفي مي‌كنيم:

1. (Ethylenediamin tetra-acetic acid) EDTA

نمك سديم يا پتاسيمEDTA از ضد انعقادهاي قوي بوده و ماده انتخابي براي كارهاي روزمره‌ي خون شناسي مي‌باشند. EDTA بوسيله‌ي عمل جذب و جداسازي خود بر روي كلسيم يونيزه خون اثر كرده و آن را از محيط حذف مي‌كند. mg2/1 (تقريباً Mmd4) از نمك بي‌آب EDTA براي جلوگيري از انعقاد ml1 خون كافي است. مصرف مقادير بيشتر اين ماده باعث چروكيدگي و دژنره شدن گلبول‌هاي سرخ و سفيد مي‌شود. مثلاً وجود EDTA به ميزان mg2 در هر ميلي‌ليتر خون باعث كاهش قابل توجهي در ميزان HCT و افزايش MCHC مي‌گردد. همچنين مقدار بيشتر EDTA باعث شكسته و متورم شدن پلاكت‌ها مي‌شود كه اين مسأله افزايش كاذب تعداد شمارش شده پلاكت‌ها را باعث مي‌شود چرا كه قطعات خرد متورم شده بقدري بزرگ هستند كه از نظر مورفولوژي كاملاً شبيه پلاكت‌هاي طبيعي گشته و در شمارش منظور مي‌گردند. بنابراين بايد كاملاً مواظب باشيم تا مقادير صحيحي از ماده‌ي ضد انعقاد را به خون افزوده و سپس با تكان دادن ظرف و برگرداندن آن خون را كاملاً با ماده ضد انعقاد مخلوط نماييم.

نمك پتاسيم EDTA قابليت انحلال خوبي در آب داشته (حدود 1650 g/L) و از اين نظر به نمك سديم آن كه قابليت انحلالي در حدود g/L108 دارد ارجح است.

وجود نمك EDTA در ظرف CBC بوسيله مشاهده يك لايه نازك نمك در داخل ظرف تأييد مي‌گردد. نمك litium جهت تحقيقات شيميايي روي خون بكار مي‌رود ولي نسبت به نمك پتاسيم حلاليت كمتري دارد. (حدود 160 g/L)

از EDTA در آزمايشاتي كه راجع به مسائل انعقادي است همچون آزمايش زمان پروترومبين- PT) استفاده نمي‌شود.

سيترات سديم (Trisodium citrate)

محلول 109/0 مول در ليتر (g/L32) تري سديم سيترات حاوي 2 مولكول آب، ضد انعقاد انتخابي براي مطالعات انعقادي محسوب مي‌شود كه براي اين كار 9 حجم خون را به يك حجم از محلول سيترات سديم مي‌افزايند. سيترات سديم ضد انعقادي است كه به صورت وسيع در آزمايش ميزان رسوب گلبول‌هاي سرخ (ESR) نيز بكار مي‌رود و براي اين آزمايش 4 حجم خون وريدي را بوسيله‌ي يك حجم محلول سيترات سديم رقيق مي‌كنيم.

 

هپارين

براي جلوگيري از انعقاد يك ml خون مي‌توان از 5/2 15 واجد بين المللي (Iu) هپارين استفاده كرد. هپارين ضد انعقادي است با تأثير خوب كه باعث تغيير شكل RBC هم نمي‌گردد. اين ماده ضد انعقاد خوبي جهت كاهش ميزان تخريب گلبول‌ها پس از نمونه گيري است.

به هر حال از خون هپارينه نبايد براي تهيه اسميرهايي كه توسط رنگ‌هاي رومانوفسكي رنگ آميزي مي‌شوند استفاده كرد زيرا در روي لام ايجاد يك زمينه آبي كمرنگي را مي‌كند كه اين حالت بخصوص در صورت وجود پروتئين‌هاي غيرطبيعي در خون مشهودتر است. هپارين بهترين ضد انعقاد براي شكنندگي اسمزي است اما در صورت قياس با EDTA از ارزش و كاربرد عملي كمتري برخوردار است.

 

كار در آزمايشگاه

خون گيري ← اساس كار آزمايشگاه خون گيري است و ركن و پايه تمام آزمايشات بستگي به رعايت تمام نكات خون‌گيري دارد.

خون گيري از نظر مراحل

1. Pre collection

2. Doring collection

3. Handing of specimen

اولين مرحله تعامل يا ارتباط است (comonication) يك خون گير خوب بايد اول يك تعامل خوب با بيمار ايجاد كند و ما به عنوان خون گير بايد به او توضيح بدهيم. شما 5 ليتر خون داريد و ما آن را مي‌خواهيم بگيريم.

47% خطاي آزمايشگاهي مربوط به pre lab است كه همان نمونه گيري است.

حدود 47% خطاها مربوط به post (گزارش و نوشتن دفتري- كامپيوتري) مي‌باشد.

و حدود 3% خطاها مربوط به كار آزمايشگاهي است.

 

Pre collection: وضعيت بيمار را بدانيم. مثلاً آيا بيمار سيگار مي‌كشد يا نه؟ پياده روي كرده است يا نه با ماشين آمده؟ فعاليت شديد ورزشي انجام داده يا نه؟ حتي از پله‌هاي چند طبقه بالا و پايين كرده يا نه؟ و...

 

Dioring collection : وقت نمونه گيري (صبح- ظهر- آخر وقت) - نحوه‌ي بستن تورنيكت بستن گارو بايد طبق استاندارد و در زمان خاصي باشد- آيا نمونه‌اي كه گرفتيد با تأخير فرستاديد؟ هموليز يا لخته است؟ آيا نسبت ماده ضد انعقاد رعايت شده يا نه؟ آيا نمونه به اندازه كافي است يا كم بوده؟ آيا مشخصات نمونه با بيمار هم خوني دارد يا نه؟ و...

 

چه تفاوتي در خون گيري وريدي و مويرگي وجود دارد؟

در خون گيري مويرگي نسبت Hb- HCT- RBCها معمولاً بيشتر است. توجه كنيد كه استانداردها فاكتورهاي خوني همه براساس خون وريدي است. ميزان پلي‌مورف نوكلئورها يا گرانولوسيت‌ها يا PMN معمولاً در خون مويرگي حدود 8% بيشتر است. ميزان مونوسيت‌ها 12% بيشتر است. ميزان پلاكت‌ها 9% بيشتر است. ميزان قند خون در مويرگي بيشتر است. در خون وريدي ميزان Ca-K و pro بيشتر است.

بايد آزمايش به سرعت انجام شود ولي اگر نشد در CBC و تا 4 الي 6 ساعت در دماي اتاق و حداكثر 24 ساعت در دماي يخچال نگهداري مي‌كنند. براي آزمايش ESR حداقل h.R.T4، براي PH و PCo₂ و Po₂ خون بدون تأخير و همان لحظه در Ice bag مي‌گيرند و به دستگاه مي‌دهند. بايد در خود بخش بيمارستان باشد.

 

Rejection نمونه: كي نمونه out مي‌شود؟‌

1. زماني كه مشخصات نمونه و بيمار هم‌خواني ندارد.

2. زماني كه هموليز است.

3. زماني كه لخته دارد.

4. زمان ارسال به آزمايشگاه اگر درست انجام نشده باشد.

5. عدم رعايت شرايط نگهداري نمونه

6. مقدار نمونه كافي باشد و...

 

ضد انعقادها

در آزمايشگاه بخصوص در بخش هماتولوژي مهمترين ضد انعقاد EDTA (اتيلن دي آمين تترااستيك اسيد) است كه براساس نوع نمك متفاوت است ممكن است K₂ (پتاسيم2)، K₃، Na₂ و Li باشد. بهترين و استانداردترين نمك K₂ است كه توسط Icsh تأييد شده.

Icsh← مؤسسه‌اي است كه روي محلول‌ها نظارت مي‌كند.

EDTA پودر است و بايد به صورت محلول در آوريم mg/Lit1650 حلاليت بالا باعث شده بهترين كاربرد را داشته باشد.

سديم (Na) mg/Lit108 قابل حل است. قدرت حلاليت K₂ بيشتر است. اول بايد محلول شود بعد در CBCهاي مربوطه مي‌گذاريم بعد در اتو (انكباتور) ^o37 مي‌گذاريم بصورت پودر در مي‌آيد. يك روز بماند خشك مي‌شود.

نوع K₃ محلول است و در امريكا بيشتر استفاده مي‌شود. 2% خطا مي‌شود و چون محلول است استفاده‌اش بيشتر است. ميزان هر 25/1-5/1 mg/icc خون است. رعايت نسبت EDTA خيلي مهم است. اگر كم باشد موجب لخته مي‌شود و اگر زياد باشد موجب اختلالات مي‌شود. به ميزان mg2 در هر cc خون باعث جذب آب توسط گلبول‌هاي خون مي‌شود. متورم مي‌شود بعد مي‌تركد بعد چروكيده مي‌شود← ميزان هماتوكريت و سديمان كاهش پيدا مي‌كند. ميزان اندكس MCHC كاهش پيدا مي‌كند. شكل گلبول‌ها عوض مي‌شود. ميزان پلاكت‌ها بصورت كاذب بالا مي‌رود. معمولاً بيشتر عدم رعايت نسبت حجم خوني است كه به CBC اضافه مي‌كنيم.

اگر نمونه خون كم باشد باعث لخته و اگر زياد باشد باعث ايجاد اختلالات مي‌شود.

اگر ميزان EDTA بيشتر باشد ميزان پلاكت‌ها بيشتر مي‌شود و باعث مي‌شود توليد آنتي بادي مي‌كند و پلاكت‌ها دور يك نوتروفيل مي‌چسبد كه به علامت عدم رعايت نسبت EDTA مي‌شود. علاوه بر نوتروفيل‌ها مونوسيت‌ها هم ايجاد مي‌كنند.

 

پديده Satelet platelet

در بررسي مورفولوژي گلبول‌ها تحت عنوان بازوفيل استيپتي در سلول‌ها ايجاد مي‌شود و در شناسايي گلبول‌ها اختلال ايجاد مي‌كند. در فعاليت فاكتور داخلي فعاليت توموزنكتور فاكتور (TNF) اختلال ايجاد مي‌كند. در لاكتوفرين هم فعاليت فاكتور را مختل مي‌كند.

 

مكانيسم عمل: كلسيم را از محيط خون حذف مي‌كند چون كلسيم براي فعاليت فاكتورهاي انعقادي نياز است و وقتي Caنباشد ديگر انعقاد رخ نمي‌دهد. سيستم هم مشابه EDTA است.

 

سيترات سديم: فيبرينوژن و بررسي فعاليت پلاكت‌ها استفاده مي‌شود. اگر براي تست‌هاي انعقادي انجام شود از رقت (1← ضد انعقاد و 10 ←خون) و براي سديمان استفاده مي‌شود. از دو رقت 29/3% و 89/3% استفاده مي‌شود.

مكانيسم عملش هم مشابه EDTA است و كلسيم را از محيط حذف مي‌كند. اگزالات آمونيوم يا اگزالات است كه براي CBC استفاده نمي‌شود براي بررسي مورفولوژي هم مناسب نيست ولي براي هماتوكريت مناسب است. نسبت مثل EDTA.

 

هپارين: يك آنتي ترومبين است يا آنتي ترومبوبلاستين است. ترومبين از فاكتور‌هاي انعقادي است. هپارين آنتي ترومبين را از محيط حذف مي‌كند. نسبت Iu/icc براي تست‌هاي اسمتيك مناسب است. هپارين شكل و اندازه سلول را تغيير نمي‌دهد و حفظ مي‌كند. باعث تخريب گلبول‌هاي سفيد مي‌شود به همين دليل براي CBC و تهيه لام محيطي مناسب نيست. براي بيماران قلبي هم استفاده مي‌شود.

با proهاي سرم كمپلكس تشكيل مي‌دهد و باعث رسوب proها در سطح خون محيطي مي‌شود.

رنگ زمينه لام رنگ آميزي شده را آبي مي‌كند.

لام نبايد پس زمينه آبي داشته باشد هپارين براي اندازه‌گيري هماتوكريت مناسب است. در لوله‌هاي موئينه اگر سر لوله موئينه آبي باشد هپارينه است و اگر سرش قرمز باشد هپارين ندارد. هپارين باعث تخريب آنزيم‌ها مي‌شود بخصوص آنزيم‌هاي پليمراز (PCR← واكنش زنجيره‌اي پليمراز) براي اين آزمايش‌ها اصلاً نبايد از هپارين استفاده كرد.

 

فلورايدسديم: بيشتر در بيوشيمي استفاده مي‌شود چون چرخه‌ي گليكوليز را مهار مي‌كند مانع سوخت و ساز قند مي‌شود. بنابراين در نمونه‌هاي خوني كه قندشان را اندازه‌گيري مي‌كنند فلورايدسديم اضافه مي‌كنيم تا قندشان حفظ شود. پس هم ضد انعقاد و هم نگهدارنده است. مكانيسم آن مثل EDTA است و باعث حذف Ca مي‌شود.

 

نتيجه‌گيري: در اين جلسه طريقه‌ي خون گيري را به صورت كامل آموزش ديديم و با ضد انعقادها به طور نسبي آشنا شديم.

 

منابع

كتاب هماتولوژي عملي دكتر اميرسيدعلي مهبد

اينترنت

 

 

گزارش كار جلسه‌ي دوم هماتولوژي عملي1

عنوان: cell blood count

اعضاي گروه: معصومه نوروزي، مريم دهدشتي

استاد: جناب آقاي دكتر حميد سماك

ترم: دوم 89-88

تهيه كننده: نوروزي

 

CBC: Cell Blood Count

CBC يك تست بسيار رايج است و از جمله آزمايشاتي كه در اين رابطه صورت مي‌گيرد؛

Cell Blood Counter است. اولين بار تهيه‌ي اسمير و سپس رنگ آميزي است.

در ابتدا سلول‌هايي را كه در اين دستگاه اندازه‌گيري مي‌شود را توضيح مي‌دهيم.

 

WBC «گلبول‌هاي سفيد»

سلول‌هاي WBC از سلول مادر چند هسته‌اي بنام P.P.S.C منشا مي‌گيرد و شناسايي آن نيز غيرممكن است كه ممكن است در خون محيطي يا مغز استخوان وجود داشته باشد.

اولين رده تشخيص ميلوبلاست، سپس پروميلوسيت و بعد ميلوسيت است و سپس سير تكاملي متاميلوسيت و باند و در آخر سر، نوتروفيل‌ها هستند.

در يك ميلوبلاست عمدتاً بيشترين حجم سلول را يك هاله‌اي از سيتوپلاسم دور هسته را گرفته است يعني 4 حجم يك سلول را هسته تشكيل مي‌دهد و معمولاً سلول‌هاي نابالغ داراي يك يا چند هستك كه در آنها جا دارد.

اين نحوه بطوري است كه وقتي سير تكاملي كامل‌تر مي‌شود و به رده‌ي نوتروفيل مي‌رسد و حجم سيتوپلاسمي را بر عهده مي‌گيرد.

 

استثنا:

پروميلوسيت داراي اندازه 21-15 ميكرون است ولي ميلوسيت 20-15 ميكرون است.

از مرحله‌ي ميلوبلاست تا ميلوسيت نمي‌توان بين بازوفيل و ائوزينوفيل تفكيك قائل شد، اين در حالي است كه سپس از رده ميلوسيت به مي‌توان تفكيك قائل شد چرا كه سلول‌ها سير بلوغ كاملي را در بر مي‌گيرند و گرانول‌هاي اختصاصي را دارا مي‌شوند.

در شمارش افتراقي نمي‌توانيم بگوييم بازوفيل يا ائوزينوفيل، ميلوسيت است بلكه مي‌توان جزء ميلوسيت آنها را شمارش كرد.

نوتروفيل‌ها 6 ساعت در خون محيطي قرار دارند و اين در حالي است كه اگر با ميكروب برخورد كنند تبديل به ماكروفاژ شده و در غير اين صورت به بافت وارد مي‌شود.

 

لنفوسيت‌ها

Small

Large → لنفوسيت → پرولنفوسيت → لنفوبلاست → لنفوسيت

Meduim

 

نكته‌اي كه در مورد لنفوسيت‌ها است اين است كه در مورد يك لنفوبلاست نسبت يك سيتوپلاسم آن بيشتر از يك ميلوبلاست است و در ثاني اطراف هسته داراي سيتوپلاسم روشن‌تر مي‌باشد و در مقايسه با سيتوپلاسم كناري در صورتي كه در يك ميلوبلاست كاملاً يك دست و آبي و گرانومي است.

در بلاست‌ها، در بعضي‌ها اجسامي بنام Aure rots داريم كه اجسام ميله‌اي شكل هستند كه فقط در ميلوبلاست‌ها ديده مي‌شود و در لنفوبلاست‌ها ديده نمي‌شود.

خيلي وقت‌ها بين يك large لنفوسيت و يك مونوسيت نمي‌توان تفكيك قائل شد.

هسته كاملاً مشابه و اندازه 20 ميكرون است و از نظر شكل كلي سلول رنگ سيتوپلاسم و كروماتين هسته مي‌توان اينها را تفكيك كرد.

 

مونوسيت:

كروماتين خطي دارد. سيتوپلاسم مونوسيت عكس اتفاق مي‌افتد و سيتوپلاسم آنها گسترش پيدا مي‌كند.

 

لنفوسيت‌:

كروماتين تو درتو مي‌باشد. سيتوپلاسم متأثر از سلول‌هاي اطراف خود مانند گلبول‌هاي قرمز تورفتگي ايجاد مي‌شود.

 

موضوع: تهيه‌ي لام خون محيطي و رنگ آميزي

رنگ‌هاي گروه رومانوفسكي در تمام دنيا، بعنوان يك روش روتين و روزمره رنگ آميزي مورد قبول و استفاده قرار گرفته‌اند.

اسميرهاي تهيه شده بلافاصله پس از خشك شدن در هوا بايد رنگ شده و هرگز نبايد بيش از چند ساعت ثابت نشده باقي بمانند. اگر اسميرها براي چند روز يا بيشتر ثابت نشده رها شوند سطح زمينه حاوي پلاسما رنگ آبي روشن بخود گرفته و در عين حال ايجاد اختلال در رنگ آميزي سلول‌هاي خوني نيز اجتناب ناپذير خواهد بود. خاصيت مهم رنگ‌هاي گروه رومانوفسكي تفكيك دقيق سلول‌ها، درجه رنگ پذيري و رنگ آميزي تفكيكي گرانول‌هاي سلول‌ها است كه مربوط به در تركيب مختلف آن مي‌باشد.

دو تركيب عمده آن آزورB «تري متيل تيونين» و ائوزين y «تترابروموفلوروئين» بوده و علت اصلي بي‌ثباتي رنگ‌آميزي وجود رنگ‌هاي اضافي ديگري است كه دو ماده اصلي را آلوده ساخته‌اند. از آن جمله مي‌توان از آزورA، آزورC، متيل ويوله و... نام برد.

بطوري كه بعضي از رنگ‌هاي تجاري حاوي 10 نوع رنگ مختلف، قابل تفكيك بروش كروماتوگرافي هستند، كه اولاً هر يك نيازمند دفعات مختلف شستشو بوده و ثانياً عمدتاً موجب بي‌ثباتي رنگ مربوطه مي‌شوند. بعلاوه رنگ‌ها شامل مقادير متغيري از نمك‌هاي فلزي هستند كه آنها نيز مي‌توانند رنگ آميزي را تحت تأثير قرار دهند. از عوامل ديگري كه روي رنگ آميزي تأثير دارند مي‌توان از مدت رنگ آميزي، غلظت رنگ، PH محلول و نسبت آزورB به ائوزينy نام برد.

تركيب رنگ رومانوفسكي اصلي و ابتدايي، متيلن بلو و ائوزين بوده است ولي بسياري از رنگ‌هايي كه بطور روزمره مورد استفاده قرار مي‌گيرد مخلوطي از آزورB و ميتلن بلو مي‌باشد. هر چند كه نياز بوجود توأم اين دو مورد بحث است. به عقيده‌ي عده‌اي وجود متيلن بلو موجب رنگ پذيري بيشتر هسته و گلبول‌هاي قرمز پلي كروماتيك «ريتكلوسيت‌ها» گشته. در فقدان آن گرانول‌هاي نوتروفيل‌ها شديدتر رنگ پذيرفته و ممكن است شبيه گرانول‌هاي توكسيك به نظر رسد.

در ميان رنگ‌هاي گروه رومانوفسكي كه در حال حاضر بكار مي‌روند:

رنگ جنر «jenner» ساده‌ترين و رنگ گيم‌سا پيچيده‌ترين آنهاست.

رنگ آميزي ليشمن كه داراي جايگاه متوسطي است، هنوز هم بطور وسيعي در رنگ آميزي اسميرهاي صوتي بكار مي‌رود هر چند كه نتايج بدست آمده از آن در مقام مقايسه با روش‌هاي رنگ آميزي جنر و گيم‌سا از ارزش كمتري برخوردار است. نتايج حاصل از رنگ آميزي بروش رايت تير نتايج شبيه روش ليشمن دارد.

 

تهيه لام خون به چند روش زير صورت مي‌گيرد:

1. روش گاور گلس cover glass method

2. روش نيچ Nedge method «لام معمولي»

3. روش spun method

4. روش مرطوب wet smear براي تشخيص انگل‌ها

5. روش ضخيم thick smear

6. روش نازك thin smear

7. روش wedye method smear

 

توضيح

- cover glass method:

اين روش با استفاده از دو لامل صورت مي‌گيرد. يك قطره روي لام اول و دومي را طوري مي‌كشيم كه يك 16 ضلعي ايجاد گردد، سپس لامل دوم را به همان حالت افقي جدا مي‌كنيم. اين روش توزيع خوبي از سلول‌ها مي‌دهد اما چون لامل‌ها شكننده‌اند و پشت لام‌ها رنگ جمع مي‌شود روش خوبي نيست و به تجربه نياز دارد.

- wedy method

- spun method:

در اين روش كه دستگاه از يك صفحه پلاتين تشكيل شده و خودش براي ما اسمير توليد مي‌كند و از نظر كاهش آلودگي، توزيع و سرعت بالا بسيار مناسب است و نام دستگاه spinner مي‌باشد.

- wet smear:

روش مرطوب بيشتر براي انگل‌ها، انكلوزيون‌هاي بادي و ديس مرفولوژي استفاده مي‌گردد.

- thin smear

هم در مورد انگل شناسي كاربرد دارد و در تست «LE» كلوپني يا كاهش WBC.

اما روش شعله شمعي، گوه‌اي يا wedy method كه نسبت به بقيه از اهميت برخوردار است. ابتدا لام بايد نازك نبوده و عاري از هرگونه آلودگي و موج و غبار.

ابتدا يك قطره خون نه خيلي كم و نه خيلي زياد در انتهاي لام ريخته و لام ديگري كه به آن spider گويند طوري با قطره خون مجاورت داده كه قبل از اينكه خون كاملاً پخش شود با سرعت و خوب مي‌كشيم. اسمير با يك لايه‌ي ضخيم شروع و به يك لايه‌ي نازك ختم مي‌شود.

لام كشنده بايد داراي لبه‌ي كاملاً صاف باشد. معمولاً طول cm5/1 خوب است و بهترين جا براي مطالعه همان قسمت مياني لام است. در انتها چون نوتروفيل‌ها و مونوسيت‌ها جمع مي‌شوند مناسب نيست و اينكه در ابتدا هم لنفوسيت‌ها وجود دارند.

از اين روش ضخيم براي مطالعه‌ي سلول‌هاي بازوفيل، كريستال‌هاي HBC، انگل‌ها stippling استفاده مي‌شود. گاهي اسمير به دليل لرزش داراي موج است. گاهي در انتهاي اسمير حالت دندانه‌دار است و اين به دليل صاف نبودن لبه‌ي لام كشنده مي‌باشد.

گاهي داراي خطوطي طولي است كه به دليل لخته‌هاي كوچك موجود در نمونه است و ميزان پلاكت‌ها كاذب تخمين زده مي‌شود. گاهي اسمير كشيده شده انتها ندارد چون قطره‌ي خون زياد است. گاهي اسمير داراي انتهاي صاف است و اين مربوط به زماني مي‌شود كه كشنده زود برداشته شود. گاهي در اسمير حباب تشكيل مي‌شود و علت آن چربي داشتن لام است. گاهي لام چرب نيست ولي حفره دارد و اين به خاطر چربي خون بيمار است. مرحله‌ي دوم ريختن الكل متانول است. خالص و عاري از هرگونه آلودگي با آب است تا فيكس خوب صورت گيرد و سپس مرحله‌ي رنگ‌آميزي.

در اين مرحله از رنگ‌هاي Romano wasky استفاده مي‌شود:

اسيدي Eozyin y: هموگلوبين و گرانول را به رنگ نارنجي در مي‌آورد.

قليايي Azour B: اسيد نوكلئيك+ هسته به رنگ آبي ارغواني