مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول: كليات

مقدمه ... 2

1-1- تاريخچه و خصوصيات گياه شناسي يونجه...... ..3

1-1-1- اهميت و گياهشناسي يونجه.. ...3

1-1-2- ژنتيك و گروه‌هاي مختلف يونجه....... ....3

1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی... ...4

1-2- اهمیت كشت بافت....... ...4

1-3- کشت بافت گیاهی ........ ...5

1- 4- تاريخچه کشت بافت يونجه.... ...7

 

فصل دوم: بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق

2-1- باززايي درون شيشه­اي..... ... 10

2-1-1- باززايي مستقيم در یونجه..... .10

2-1-2- باززايي غيرمستقيم در یونجه...... ..13

 

فصل سوم: روش تحقیق

3-1- رقم مورداستفاده....... ..24

3-2- محيط کشت، ترکيبات و آماده سازي آن........ ...24

3-2-1- محلول­هاي ذخيره مواد معدني برای تهیه محیط کشتSH .....34

3-2-2- محلول هاي ذخيره مواد تنظیم کننده رشد.. ....25

3-3- شرايط كشت، ضد عفونی بذر و کشت ریزنمونه­ها........ .26

3-3-1- باززايي مستقيم از گره ساقه.... ...26

3-3-2- سازگاری گياهچه­ها........ 28

3-4- باززايي غيرمستقيم .........

3- 5- روش و ابزار گردآوري اطلاعات..................................................................................................................................................................................30

3-6- روش آماري و تجزيه داده­ها.........................................................................................................................................................................................30

 

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل اطلاعات

4-1- القاء جوانه و باززایی .....................................................................................................................................................................................................32

4-1-1- القاء جوانه در محیط کشت SIM I......................................................................................................................................................................32

4-1-2- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM I...........................................................................................................................................................35

4-1-3- القاء جوانه در محیط کشت SIM II....................................................................................................................................................................37

4-1-4- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II ........................................................................................................................................................40

4-1-5- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه چند­ساله و یکساله در القاء جوانه و باززايي شاخساره در محيط كشت SIM I....................................43

4-1-5-1- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه­هاي چند­ساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM I...........................................................................43

4-1-5-2- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه­هاي یکساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM I..............................................................................43

4-1-5-3- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه­ چند­ساله در باززايي شاخساره در محيط كشت SIM I.......................................................................44

4-1-5-4- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه­ یکساله در باززایی شاخساره در محيط كشت SIM I..........................................................................45

4-1-6- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه چند­ساله و یکساله در القاء جوانه و باززايي شاخساره در محيط كشتSIM II....................................45

4-1-6-1- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه چندساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM II..................................................................................45

4-1-6-2- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه­ يكساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM II.....................................................................................46

4-1-6-3- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه چند­ساله در باززايي شاخساره در محيط كشت SIM II.....................................................................47

4-1-6-4- اثر ژنوتيپ­هاي مختلف يونجه يكساله در باززايي شاخساره در محيط كشت SIM II.........................................................................47

4-2- ریشه­زایی........................................................................................................................................................................................................................48

4-2-1- ايجاد ريشه در يونجه­هاي چند­ساله......................................................................................................................................................................48

4-2-2- درصد ايجاد ريشه در يونجه­هاي چند­ساله..........................................................................................................................................................48

4-2-3- درصد ايجاد ريشه در يونجه­هاي يكساله..............................................................................................................................................................50

4-3- سازگاري و انتقال به شرايط گلخانه...........................................................................................................................................................................50

4-4- القاء كالوس در یونجه­های چند­ساله و یکساله.........................................................................................................................................................51

4-4-1- باززايي غيرمستقيم از كالوس يونجه.....................................................................................................................................................................52

 

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

5-1- يونجه­هاي چند­ساله.......................................................................................................................................................................................................55

5-1-1- باززايي مستقيم ........................................................................................................................................................................................................55

5-1-1-1- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................55

5-1-1-2- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO₃.........................................................................................................56

5-2- يونجه­هاي يكساله..........................................................................................................................................................................................................56

5-2-1- باززايي مستقيم ........................................................................................................................................................................................................56

5-2-1-1- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................56

5-2-1-2- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO₃...........................................................................................................57

5-3- باززايي غير مستقيم در يونجه­هاي چند­ساله و یکساله..........................................................................................................................................59

5-4- نتيجه گيري و پيشنهادات...........................................................................................................................................................................................60

فهرست منابع و ماخذ.............................................................................................................................................................................................................61

چکیده انگلیسی.......................................................................................................................................................................................................................67

 

 

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 3- 1- ترکيب محلول­‌هاي ذخيره (50×‌) پنجگروه نمکي غير آلي فرمولاسيونSH....................................................................................25

جدول 3-2- تركيبهاي مختلف تنظیم­کننده­های رشدی مورد استفاده در محيط كشت پايه MS حاويويتامينهايB5 براي القاء جوانه و باززايي در ارقام و گونه هاي مختلف يونجه..........................................................................................................................................................................28

جدول 3-3- تركيبهاي مختلف تنظیم­کننده­های رشد مورد استفاده در محيط كشت پايه MS حاوي ويتامين­هاي B5 براي القاء كالوس در ارقام و گونه­هاي مختلف يونجه...............................................................................................................................................................................................29

جدول 3-4- محيط كشت­هاي مختلف حاوی تركيب­هاي مختلف تنظیم­کننده­های رشدی مورد استفاده براي رشد كالوس در ارقام و گونه­هاي مختلف يونجه ...................................................................................................................................................................................................................29

جدول 3- 5- تركيب­هاي مختلف تنظیم­کننده­های رشدی مورد استفاده در محيط كشت پايه MS حاوي ويتامين­هاي B5 براي باززايي غير مستقيم در ارقام و گونه­هاي مختلف يونجه.........................................................................................................................................................................29

جدول 4-1- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد جوانه­های القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه، اردوباد................................................................................................................32

جدول 4-2- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در 2 گونه يونجه یکساله M. rigidula و :M.scutellata.......................................................................................................................................34

جدول 4-3- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه، اردوباد.......................................................................................................36

جدول 4-4- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M. rigidula وM. scutellata....................................................................................................36

جدول 4-5- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت ميانگين تعداد جوانه­های القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه، اردوباد..................................................................................38

جدول 4-6- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M. rigidula و M. scutellata...............................................................................39

جدول 4-7- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدونAgNO₃ بر روی صفت میانگین تعدادشاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه،اردوباد.............................................................................40

جدول 4-8- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشت­هاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدونAgNO₃بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M.rigidula وM.scutellata............................................................................42

جدول 4-9- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در سه رقم يونجه چند­ساله.............................................................43

جدول 4-10- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در دو گونه يونجه یکساله.............................................................44

جدول 4-11- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززايي در سه رقم يونجه چند ساله...............................................................44

جدول 4-12- اثر غلظت­های ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززايي در دو گونه يونجه یکساله....................................................................45

جدول 4-13- اثر غلظت­هاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO₃برای القاء جوانه در سه رقم يونجه چند­ساله.......................................46

جدول 4-14- اثر غلظت­هاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO₃برای القاء جوانه و باززايي در دو گونه يونجه يكساله.........................46

جدول 4-15- اثر غلظت­هاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO₃برای باززايي در سه رقم يونجه چند ساله............................................47

جدول 4-16- اثر غلظت­هاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO₃برای باززايي در دو گونه يونجه يكساله.................................................48

جدول 4-17- میزان القاء كالوس در ارقام و گونه­هاي مختلف يونجهتحت تاثیر محیط کشت­های مختلفCIM............................................51

جدول 4-18- وزن كالوس­هاي رشد يافته در محيط CGM در ارقام چند­ساله قره يونجه و همداني..................................................................52

 

فهرست اشکال

شكل 3-1- ضد عفوني و كشت بذور يونجه جهت تهيه ريزنمونه..................................................................................................................................27

شکل 4-1- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخساره­زايي و ريشه­زايي در ژنوتيپ­هاي چند­ساله يونجه......................................................................49

شكل 4-2- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخساره­زايي و ريشه­زايي در دو گونه يونجه يكساله................................................................................51

شكل 4-3- مراحل مختلف باززايي غيرمستقيم يونجه چند­ساله....................................................................................................................................53

 

 

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار 4-1- تاثير محيط كشت­هاي SIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد جوانه­های القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه، اردوباد.....................................................................................................................................33

نمودار 4-2- تاثير محيط كشت­هايSIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در 2 گونه يونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata...........................................................................................................................................................34

نمودار 4-3- تاثير محيط كشت­هاي SIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد گياهچه­هاي باززا شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه، اردوباد.....................................................................................................................................36

نمودار 4-4- تاثير محيط كشت­هاي SIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد گياهچه­هاي باززا شده در هر ريزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata................................................................................................................................37

نمودار 4-5- تاثير محيط كشت­هاي SIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت ميانگين تعداد جوانه­های القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند­ساله همداني، قره يونجه، اردوباد.......................................................................................................38

نمودار 4-6- تاثير محيط كشت­هاي SIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata.................................................................................................40

نمودار 4-7- تاثير محيط كشت­هايSIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO₃ بر روی صفت ميانگين تعداد گياهچه­هاي باززا شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند ساله همداني، قره يونجه، اردوباد....................................................................................................41

نمودار 4-8- تاثير محيط كشت­هايSIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه وبدون AgNO₃بر روی صفت میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله...........................................................................................................................................................42

نمودار 4-9- درصد ايجاد ريشه تحت تاثير تركيبات مختلف تنظیم کننده­های رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در سه رقم يونجه همداني، قره يونجه و اردوباد...............................................................................................................................................................................49

نمودار 4-10- درصد ايجاد ريشه تحت تاثير تركيبات مختلف تنظیم کننده­های رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در دو گونه يونجه M. rigidula و M. scutellata........................................................................................................................................................................50

 

 

 

 

 

 

 

فصل اول: کلیات

 

 

مقدمه

يونجه(Medicago sativa L.) یکی از مهم‌ترین گياهان علوفه‌اي براي تغذيه دام می‌باشد كه با وسعت كشت جهانی بیش از 40 میلیون هکتار، زراعت آنامروزه بسيار توسعه يافته است (زانگ و همكاران 2010). همزيستي يونجه با باكتري‌هاي ريزوبيوم همزيست و در نتيجه تثبيت نيتروژن، حفظ ساختار مناسب خاک و اثرات بالقوه این گیاه در مدیریت آفات به عنوان مهم‌ترین گیاه تناوبی، اهميت آن را در كشاورزي پايدار افزايش داده است(قوامي و همكاران، 1377(. يونجه اتوتتراپلوئيد (2n = 4X = 32) و دگرگشن بوده و تنوع ژنتيكي زيادي بين ارقام مختلف آن ديده می‌شود. و به دلیل ظرفیت باززایی خوب درون شیشه­ای آن برای یک مدت زمان طولانی از اهداف مطالعات ﮊنتیکی و زیست شناسی سلولی- مولکولی بوده است(اينچوا و همكاران، 2005و شائو و همكاران، 2000). جنس Medicago ترکیبی از گونه­های چند­ساله و یکساله می‌باشد. یونجه­های یکساله در بیش از 250 منطقه جغرافیایی ایران پراکنده هستند که استان آذربایجان غربی یکی از نواحی رویشی آن‌ها است (حيدري شريف آباد و همكاران، 1379). به طور كلي، اگر ژنوتيپ­هاي يونجه مورد بررسي قرار گيرند، امكان يافتن يك ژنوتيپ با قابليت باززايي خوب در ژرم پلاسم يونجه وجود دارد (اينچوا و همكاران،2005). افزایش کیفیت و میزان توليد و مقاومت در برابر بیماری‌ها جزء اهداف اصلی برای اصلاح یونجه (.Medicago sativa L) می‌باشد، اما بیشتر دستاوردها در گذشته با استفاده از روش‌های كلاسيك اصلاحي به دست آمده‌اند ، نه از تکنیک‌های مهندسی و اين به علت عدم وجود پروتوكل باززايي مؤفق براي طيف وسيعي از ژنوتيپ هاي يونجه می‌باشد (لي و همكاران،2009).اينگياه دارايسابقهتاريخي طولانی بوده و قدمتآنبهابتدايتاريختمدن مي‌رسد (قوامي و همكاران، 1377). احتمالا منشا آن ناحیه‌ی كائوكاسوس (Caucasus) يعني شمال شرقي تركيه، ارمنستان و شمال غربي ايران می‌باشد (میکاد و همكاران، 1988). سازگاری یونجه به دامنه‌ی وسیعی از شرایط آب و هوایی سبب شده است كه این گیاه در بيش از 40 ميليون هكتار از اراضي دنيا كشت شود (زانگ و همكاران، 2010)،كه در اين ميان آمريكا بيشترين سطح زير كشت را دارا مي‌باشد، بطوريكه آمريكا، اروپاي شرقي و آرژانتين به تنهايي %70 مناطق سطح زير كشت يونجه را به خود اختصاص مي‌دهند (ورونسي و همكاران، 2010). در ايران نيز كه از خاستگاه‌هاي اوليه يونجه بشمار مي‌رود، اين گياه در 600 هزار هكتار از اراضي كشور كشت مي‌شود كه از اين سطح زير كشت حدود 3/4 ميليون تن علوفه خشك عاید کشاورزان می‌شود (آمارنامه وزارت جهاد كشاورزي، 1388). جنس Medicago به شاخة گياهان گلدار^[1]، زيرشاخة نهاندانگان^[2]، ردة دولپه‌ای‌ها^[3]، راستة روزالس^[4] و تيرة پاپيلوناسه‌آ^[5] متعلق است كه شامل گونه‌هايي است كه از لحاظ ويژگي‌هاي مورفولوژيكي بسيار متنوع می‌باشند و حدود دو سوم اين گونه‌ها يكساله و بقيه چندساله هستند (لسينز و لسينز، 1979 و ورونسي و همكاران 2010).

 

 

1-1- تاريخچه و خصوصيات گياه شناسي يونجه

1-1-1- اهميت و گياهشناسي يونجه

يونجة زراعي (Medicago Sativa L.) كه ملكه گياهان علوفه‌اي نيز ناميده مي‌شود در بخش وسيعي از اروپا و آمريكا به عنوان مهم‌ترين علوفة لگومي شناخته شده است. اين گياه اغلب جهت مصرف به صورت علوفة خشك، علوفة دِهيدراته، حبه‌هاي علوفه‌اي، علوفة تازه، کود سبز و گهگاهي چراگاه كشت مي‌شود (ورونسي و همكاران2010). بقاياي يونجه مواد آلي خاك را افزايش مي‌دهد و سيستم ريشه‌اي آن مواد غذايي موجود در اعماق خاك را در بين لايه‌هاي خاك به حركت در‌آورده و سبب بهبود ساختار خاك، نفوذپذيري نسبت به آب و ظرفيت نگهداري آب مي‌شود. كشت يونجه به مقدار كمي به علف‌كش و آفت‌كش نياز دارد و به دلیل همزيستي باكتري‌هاي تثبيت كنندة نيتروژن (Sinorhizobium meliloti)با ريشه آن به كود نيتروژنه نيازي ندارد، كه اين ويژگي‌ها با ملاحظات ملي و بين‌المللي فعاليت‌هاي كشاورزي در ارتباط با محيط زيست سازگار مي‌باشد. همچنين مزارع يونجه جهت غني‌سازي تنوع زيستي بسيار مطلوب مي‌باشند (ورونسي و همكاران، 2010). اين گياه داراي پروتئين زيادي بوده و حاوي اكثر اسيدهاي آمينه، ويتامين‌ها و هیدرات‌های كربن مي‌باشد ومیزان فيبرعلوفه آن نيز كم مي‌باشد (زانگ و همكاران 2010 و مونتیرو و همکاران، 2003).

 

1-1-2- ژنتيك و گروه‌هاي مختلف يونجه

جنس Medicago داراي اشكال ديپلوئيد و تتراپلوئيد M. sativa spp. Sativa،M.Sativa spp. FalcataوM. Sativa spp. Glutinosaمي‌باشد، كه اين گونه‌ها به آسانی به اهم تلاقي يافته و داراي كاریوتيپ مشابهي مي‌باشند. يکي از موانع عمده در تبادل ژن بين آن‌ها سطح پلوئيدي است كه اين عامل مي‌تواند با توليد گامت‌هاي كاهش نيافته مرتفع گردد (مک کوی و بینگهام، 1988). اشكال ديپلوئيد و گل ارغوانی M. Sativa، M. Sativa spp. Coerulea ناميده مي‌شوند در حالي كه اشكال تتراپلوئيد و گل ارغواني M. Sativa، M. Sativa spp. Sativa ناميده مي‌شوند كه يونجه‌هاي زراعي چندساله معمولاً در اين گروه قرار مي‌گيرند. در مقابل فرم‌هاي بالا، M. Sativa spp. Falcate داراي گل‌هاي زرد رنگ بوده و اشكال ديپلوئيد را شامل می‌شود كه داراي 4 گونه چند­ساله تتراپلوئيد و دو گونه چندساله هگزاپلوئيد مي‌باشد (ورنوسي و همكاران، 2010). در حدود 3/1 جنس Medicao را گونه­های یکساله تشکیل می‌دهند که اکثرا دیپلوئید و خودگشن هستند و از بعضی جهات مانند رشد سریع‌تر، کیفیت علوفه ای و مقدار پروتئین خام نسبت گونه­های چند­ساله برتریت نشان می‌دهند (زو و همكاران،1996). یونجه‌­های یکساله (Medic) ممكن است به عنوان يك منبع مفيدبراي ژن‌های دخيل در صفات زراعی مهم مانند مقاومت به تنش­هاي زنده و غير زنده باشند (اينچوا و همكاران، 1999).

 

1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی

یونجه همدانی: در برابر سرما مقاوم بوده و ارتفاع آن بیش از سایر ارقام سردسیری و نیمه گرمسیری است. به طوری که ارتفاع ساقه به ۸۰ تا ۹۰ سانتی متر می‌رسد. برگ‌های آن کوچک‌تر و نازک‌تر و باریک‌تر از سایر ارقام است. این رقم در ارتفاعات زیاد به خوبی رشد می‌کند. دانه­های آن کوچک و در حدود یک تا ۱/۲ میلی متر است. یونجه همدانی رنگ بنفش دارد و برای کشت در مناطق سرد و مرتفع مناسب است.

قره یونجه: مرکز عمل آوری آن آذربایجان است. در برابر سرما مقاوم است و برای کشت به صورت یونجه یکساله و حتی دیم در مناطق سرد به خصوص آذربایجان مناسب است.

 

1-2- اهمیت كشت بافت

كشت بافت تكنيكي است كه امكان توليد گياه در محيط درون شيشه­اي را فراهم می‌کند. اساس اين تكنيك توتي پوتانسي است كه بيان می‌کند هر سلول گياهي داراي كليه اطلاعات ژنتيكي لازم براي تبديل شدن به يك گياه كامل است. بنابراين كشت سلول، بافت يا اندام اين امكان را فراهم می‌کند كه با كشت يكي از اجزاي فوق ساير قسمت‌های گياه تشكيل شود. كشت بافت داراي اهداف متعددي است كه از جمله مهم‌ترین آنها می‌توان به موارد زير اشاره كرد:

1- پي بردن به نيازهاي تغذيه­اي سلول و توانايي سلول

2- ريزازديادي يا تكثير سريع در فضاي محدود

3- فراهم آوردن دست ورزي ژن يا مهندسي ژنتيك

4- توليد گياهان هاپلوئيد

5- به نژادي و تهيه نژاد­هاي مقاوم به شوري وخشكي

6- رفع مشكلات مربوط به رويش سخت بذرها

7- كشت پروتو پلاست و هيبريداسيون سوماتيكي

8- كوتاه كردن مراحل چرخه زندگي گياه وتسريع گلدهي

9- طولاني كردن مرحله رويشي در گياهاني كه قسمت‌های رويشي آن‌ها مصرف می‌شود(مانند يونجه)

10- توليد گياهان عاري از ويروس

11- حفظ ونگهداري ذخاير ژنتيكي

12- توليد متابوليتهاي ثانويه

13- گلدهي در محيط درون شیشه‌ای

14- رفع مشكلات خودناسازگاري

از مشكلات كشت بافت می‌توان به انواع آلودگی‌های باكتريايي وقارچي اشاره كرد كه در برخي از موارد كار را با شكست مواجه می‌سازد. همچنين كشت بافت نياز به تجربه دارد وگياهان رشد كرده در محيط درون شيشه­اي به شرايط رطوبت بالا عادت کرده‌اند، بنابراين بايد مرحله سازگاري را سپري كرده وسپس به خاك منتقل شوند (حسندخت و همكاران،1385).

 

1-3- کشت بافت گیاهی

ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک­های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه­های گیاهی از کار اولیه مورل (1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمک‌های معدنی توسط موراشیگ و اسکوگ (1962) ناشی شد. از آن به بعد، این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت وامروزه یک نقش کلیدی در تکثیر ، اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا می‌کند.کشت بافت گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است: 1 ـتوانمندی[6]که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است. توانمندی بر این مطلب دلالت می‌کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می‌باشد. گر چه از لحاظ نظری همه سلول­های گیاهی توانمند هستند، با این حال سلول‌های مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند. 2ـ تمایز زدایی[7]، که توان سلول‌های بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلول‌ها با بازتمایزی[8] اندام­های جدیدی را سازماندهی می‌کنند.3ـ شایستگی[9]، که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می‌کند. برای مثال، سلول­های با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویان­های کاملاً فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح، واژه ناشایستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان می‌شود.

 

3-1 انواع کشت درون شیشه‌ای :

1 ـ کشت گیاهان کامل ( برای مثال، کشت بذر ارکیده ، کشت دانه رست [10]

2ـ کشت اندام ( برای مثال، کشت مریستم)،کشت شاخساره[11]: کشت ریشه- کشت برگ- کشت به ساک،کشت رویان

3ـ کشت کالوس

4 ـ کشت سلول

5 ـ کشت پروتوپلاست

روش‌های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می‌باشد. یاخته‌ها، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی در طی مرحله تمایز زدایی، توده‌هاییاخته‌ای بی‌شکل و متراکمی به نام پینه را تولید می‌نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایزیافته و بافت‌های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می‌آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش‌های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری‌زا، حفظ ذخایـر گیاهی ارزشمند در کشت‌ها و در درجه حرارت‌های پاییـن و اصلاح گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه‌ای است که بسیاری از دانشگاه‌های دنیا آن را در دوره‌های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده‌اند و حتی در بعضی از کشورها دوره‌های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده‌اند (عادلي مسبب، 1378).

یکی از مهم‌ترین مسائل حل نشده در زیست شناسی عمومی، تنظیم رشد و نمو است.یک روش آزمایشی که در پژوهش‌های تنظیم رشد و نمو گیاه، زیاد بکار برده می‌شود، کشت قسمت­های قطع شده گیاهی و ریز نمونه­های بافتی مشخص روی محیط کشت مصنوعی در آزمایشگاه است.اسکوک و همکارانش کشف کردند که اگر بافت آوندی همراه با ریز نمونه­های مغز روی یک محیط کشت شامل اکسین کشت شود، بافت تحریک شده و متحمل تقسیم سلولی می‌گردد. همچنین کشف کینیتین بدین علت مهم بود که مشخص کرد تقسیم سلولی می‌تواند به واسطه ماده شیمیایی ساده­ای تحریک گردد.بنابراین،با کشف کینتین حدس زده شد که ممکن است مولکول‌های طبیعی با

 

ساختمان مشابه کینتین فعالیت تقسیم سلولی داخل گیاه را تنظیم کنند. که بعضی از سیتوکینین­های مصنـوعی، طبیعی و ترکیباتی مشابه که در کشت بافت استفاده می‌شوند عبارتند از: زآتین، کینیتین (6- فورفوریل آمینو پورین یا N6– فورفوریل آدنین)، BAP، ZIP،PBA، تیدیازورون.همچنین چندین تنظیم کننده رشد گیاهی که در کشت بافت استفاده می‌شوند شامل:اتیلن، آبسیزیک اسید، سیتوکینین­ها (کینتین)،اکسین­ها (اینولیل 3-استیک اسید) IAA، جیبرلین­ها (جیبرلیک اسید) GA3، زآتین، 2،4- دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D)، نفتالن استیک اسید (NAA).اسکوک و میلر (1957) نمونه بی­نظیری از تنظیم هورمونی ریخت­زایی در ریزنمونه­های مغز توتون ارائه کردند. این تحقیق مهم به طور جالب، اثر متقابل ظریف و کمّی بین اکسین و سیتوکینین در کنترل تشکیل جوانه و ریشه از ریز نمونه­های مغز را نشان داد.با ترکیب خاصی از غلظت­های IAA و کینیتین، بافت مغز به صورت کالوس تمایز نیافته­ای رشد کرد و با تغییر نسبتIAA : KIN آن‌ها موفق به تولید جوانه یا ریشه از ریز نمونه­ها شدند (آزادي و همكاران، 1382).

 

1-4- تاريخچه کشت بافت يونجه

باززايي گياه يونجه (.Medicago sativa L) از طريق جنين­زايي از حدود 30 سال قبل گزارش شد. در آن زمان، يونجه يكي از معدود گياهان مهمي بود كه قابليت باززايي از كشت بافت را نشان داد.تحقیقات وسیعی در زمینه بهینه­سازی کشت بافت یونجه انجام شده است و اکثرا باززایی غیرمستقیم از طریق جنین­زایی سوماتیکی گزارش شده است(بلوچي و همكاران، 1378 و اينچوا و همكاران،2003 و 2005).باززایی غیرمستقیم بسیار زمانبر و طافت­فرسا بوده و معمولا با تغییرات سوماکلونی وسیع و خصوصیات مورفولوژیکی غیرنرمال همراه است.موفقیت در کشت بافت یونجه­های چند­ساله برای اولین بار توسط Saunders و Bingham در سال 1972 از طریق جنین­زایی سوماتیکی گزارش شد (اينچوا و همكاران، c2005 ). در حال حاضر این گیاه به عنوان يك بیوراکتور سبز برای تولید متابولیت­های ثانویه و پروتئین­های نوترکیب، امکان بهبود کیفیت علوفه و سایر صفات مهم مانند مقاومت به تنش­های زیستی و غیرزیستی در حوزه زیست­فناوری گیاهی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. تهیه یک روش مناسب و کارا برای باززایی کامل، سریع و تولید انبوه گیاه تحت شرایط درون شیشه‌ای از مهم‌ترین اهداف مطالعات کشت بافتی می­باشد که می‌تواند در مطالعات مهندسی ژنتیک و همچنین در برنامه­های اصلاحی مورد استفاده قرار گیرد. با این حال تاکنون یک روشی که برای باززایی در طیف وسیعی از ژنوتیپ­های یونجه مناسب باشد، ارائه نشده است و پاسخ به کشت بافت در این جنس شدیدا وابسته به ژنوتیپ می‌باشد و این وضعیت، کاربرد روش­های بیوتکنولوژیکی در بهبود ژنتیکی آن را محدود می­کند(مولتراسيو و همكاران، 2004 و سمك و همكاران، 2004 وكپسين و همكاران،2006). جنين­زايي سوماتيكي يكی از روش­های مهم در کشت بافت به شمار می‌آید که در اکثرگونه­هاي گياهي مورد استفاده قرار می‌گیرد اما به دلیل مشكلات متعددي مانند سرعت رشد، تبديل آهسته و باززايي دوره­اي جنين­زايي سوماتيكي به گياهچه­هاي نرمال كاربرد رايج آنرا محدود می‌کنند (ايچنوا و همكاران،2005). اگرچه در بسياري از گياهان، بافت تمايز نیافته به سختی بعد از كشت تبديل به گياه می‌شود، اما در يونجه امكان باززايي از كالوس تشكيل شده از بافت‌های متعدد حتی پروتوپلاست و سلول‌های گياهي فاقد ديواره سلولي وجود دارد. اگرچه گونه­هاي يونجه چند­ساله ممكن است از طريق روش‌های درون شيشه­اي غيرمستقيم و يا مستقيم باززا شوند، اما اين گونه­ها به دليل درجه بالاي هتروزيگوسيتي و اندازه بزرگ ژنوم، نمی‌توانند به عنوان مدل براي لگومها به كار روند. يونجه­هاي يكساله نسبت نزديكي با يونجه زراعي دارند اما آن‌ها ديپلوئيد و خودگشن بوده و داراي سيكل زندگي كوتاه و محدود هستند؛ بنابراين از نظر تحقيقات مولكولي و ژنتيكي خيلي مناسب‌تر از گونه­هاي چند­ساله و دگر بارور زراعي M. sativa هستند. همچنين گونه­هاي وحشي ممكن است به عنوان يك مخزن مفيد براي ژن‌های دخيل در صفات زراعي مثل مقاومت به تنش­هاي زنده و غيرزنده باشند (ايچنوا و همكاران،1999).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل دوم:

بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2-1- باززايي درون شیشه‌ای

2-1-1- باززايي مستقيم در یونجه

از زمان اولين گزارشات از باززايي درون شيشه­اي گياهان همه تکنیک‌های درون شيشه­اي عمده بر روي بافت‌ها وسلول­هاي يونجه به كار گرفته شده است.گزارشات متعددي از تراريختي ژنتيكي توسط Agrobacterium tumefaciens در يونجه وجود دارد.به هر حال در تعداد زيادي از اين روش‌ها،يك تعداد تراريختي ايجاد شده ويا خيلي وابسته به ژنوتيپ هستند(شائو و همكاران،2000).

باززايي گياه از طريق تشكيل مستقيم شاخساره ها ( شامل مجموعه­هايي از جوانه­ها ) براي دو گونه يكساله يونجه Medicago orbicularis و Medicago arabica در محيط كشت حاويTDZ mg/l 5/. و از قطعات گره ساقه و برگچه توسط اينچوا و همكاران در سال 2005 به دست آمده است. تعداد جوانه­هاي باززا شده در Medicago orbicularis بين 11-13 جوانه در هر ريزنمونه بود،در حالي­كه درMedicago arabicaكمتر از 5-6 عدد بود.

لي[12]و همكاران در سال 2009 ، باززايي مستقيم در رقم يونجه چندسالهMedicago sativa L. Eurekaرا با استفاده از ريزنمونه تهيه شده از گره كوتيلودني مورد بررسي قرار دادند و محيط كشت مورد استفاده محيط كشت MS بود. هورمون‌های بکار رفته عبارت بود از:

1)در مرحله1 باززايي: mg dm^-3) 1-0(TDZ )mg dm-³3( AgNO₃

2) در مرحله2 باززايي:mg dm^-3) 1/0-01/0 (TDZ

3) الف: محيط MS بدون هورمون

نتايج به دست آمده نشان داد كه بيش از 3/83% شاخساره­ها،ريشه­دار شدند، و همه گياهچه­ها به محيط بيرون سازگارشده ودر خاك استقرار يافتند. اين تحقيق بر روي 8 ژنوتيپ به كار گرفته شد و محدوده فراواني­هاي باززايي از 8/63 تا 5/82 % بود. اين تحقيق نشان داد كه اگرچه شاخساره ايجاد شده از ريزنمونه­هاي جوانه راسي در همه محيط­هاي كشت با ترکيب هورموني تيديازورون (TDZ ) با غلظتmg dm^-31-0 توسعه يافتند، اما بهترين توسعه و القاء جوانه درجوانه­هاي راسي (7/91%) بر روي محيط كشت MS حاويmg dm^-31/0TDZ به دست آمد.

مهرا[13]وچيما[14]در سال 1980، تشكيل چند­شاخه به وسيله فعال شدن جوانه­هاي جانبي نارس درپوپولوس[15] برروي محيط كشت MS حاوي BAP را گزارش كردند.روت[16]و همكاران در سال 1989 تشكيل چند­شاخه را بر روي ريزنمونه گره Rosa hybrida بر روي محيط MS غني شده با BAP، GA₃ و casein hydrolysate گزارش كردند.گورل[17]وگلشن[18]در سال 1998 ، تكثير شاخه از نوك شاخه Amygdalus communis بر روي محيط MS با تركيب mg/l 1/0IBA وmg/l 1BAP گزارش كردند.ايجاد چند­شاخه از نوك شاخه(cm 2-1) از گياهان رشديافته در مزرعه Paederia foetida وCantella asiatica بر روي محيط MS غني شده با mg/l1BAP در 7 روز پس از كشت گزارش شده است) سينگ[19]وهمكاران، 1999).در Bixa orellana ،شارن[20]و دسااوزا[21]در سال 2000 از ريزنمونه­هاي جوانه راسي[22] وگره ساقه[23] بر روي محيط MS غني شده با mg/l 2-ip1(2-isopentenyl adenine ) ، گياه باززايي نمودند.افزايش mg/l) BAP3/0)و mg/l ) kinetin2/0(پاسخ خوبي به تكثير شاخه درWithania somniferaبادرصد باززايي85% داده است(كولكرني[24]وهمكاران،2000).امين[25]وهمكاران در سال 2002 گزارش كردند كه تشكيل جوانه­هاي جانبي بر روي قطعات گره ساقه Lxora fulgens بر روي محيط كشتMS غنی شده باmg/l) NAA 1/0mg/l) BA + (5/0(امكان پذير می‌باشد.محيط كشت MS حاوي تنظيم كننده­هاي رشدي مثل mg/l 5/0BAP به همراه mg/l01/0NAA بهعنوان بهترين نتيجه در Utleria salcifoliaدر باززايي گياهچه گزارش شده است (گانگاپرسد[26]وهمكاران،2003). همچنين بيشترين ميزان تشكيل شاخه از مريستم درگياه Origanum vulgare توسط گلنيوسكي[27] همكاران در سال 2003 گزارش شد.در Crataeva magnaتكثير سريع بر روي محيط MS به همراه μm8/8BAP به دست آمد (بنيامين[28]وهمكاران،2004).در حالي­كه در Peltophorum pterocarpum ، بالاترين تعداد شاخه­ها بر روي محيط كشت MS به همراهmg/l 2 kinetin و mg/l 5/0NAAمشاهده شد (اودين[29]وهمكاران ،2005).

چن[30]وهمكاران در سال 2000، تشكيل شاخه­هاي نابجا از ريزنمونه­هاي ميان گره ساقهAdenophora triphylla (يك گياه دارويي مهم) را گزارش كردند. در تحقيق سرينيواسان[31] و همكاران در سال 2006،TDZ بيشترين پاسخ را در ايجاد فراواني و متوسط تعداد شاخساره­های یونجه نشان داده است. در يونجه سطحmg/l 5/0 TDZ باعث القاء بيشترين فراواني ( 92% ) همراه با متوسط تعداد 7 شاخساره بعد از 30 روز از كشت شده است.اولين بار در سال 1982 گزارش شد كه TDZداراي فعاليت سيتوكينيني می‌باشد. از آن زمان به بعد TDZ با موفقيت در كشت درون شيشه­اي به منظور القاء تشكيل شاخساره­هاي نابجا و براي افزايش تكثير جوانه­هاي جانبي مورد استفاده قرار گرفت. تعداد شاخساره­هاي توليد شده در محيط كشت حاوي TDZ برابر و يا بيشتر از تعداد شاخه­هاي ايجاد شده بر روي محيط كشت حاوي سيتوكينين­هاي داراي پورين می‌باشد. غلظت­هاي پايين TDZ( mg/l088/0-0022/0) بزاي ريزازديادي موثر می‌باشد.

يك پروتوكل باززايي با القاء تعداد زياد شاخساره­هاي نابجا براي گياه بذرالبنج(Hyoscyamus niger L.) با استفاده از TDZ توسطاورنبي[32]در سال 2005 توسعه داده شد. ريزنمونه­هاي هيپوكتيل، كوتيلودون و ساقه بر روي محيط موراشيك و اسكوك (MS) حاوي غلظت­هاي مختلف [33](BAP) و TDZ كشت شدند. محيط كشت MS حاوي µM(0.016 µL)16 TDZ در ايجاد 100% باززايي و با 1953 شاخساره در هر ريزنمونه هيپوكتيل بسيار موثر بود. گياهچه­ها بر روي محيط MS حاوي غلظت­هاي مختلف[34]IBA و[35]NAA ريشه دار شدند. گياهچه­هايي با ريشه زايي و بقاء بالا با استفاده از محيط كشت MS نصف غلظت حاوي µM 8 IBA به دست آمد.

ماليكارجونا[36]و همكاران در سال 2007 يك روش درون شيشه­اي براي ازدياد Holarrhena antidysenterica Wall. را با استفاده از ريزنمونه­هاي گره از درخت­هاي بالغ رشد كرده در مزرعه توسعه دادند. صرفنظر از غلظت­ها و تركيبات تنظيم كننده­هاي رشد مورد استفاده، جوانه­هاي جانبي و انتهايي هنگامي كه در محيط كشت موراشيك و اسكوك (MS) كشت شدند جوانه زده و رشد يافتند. بيشترين تعداد شاخساره­ها در زمانيتشكيل شد كه شاخساره­هاي جوانه زده از محيط پايه MS به محيط كشت MS حاوي[37] BA (mg/dm³2 (وNAA ( mg/dm³5/0( واكشت شدند. شاخساره­هاباتعداد بيشتري از طريق واكشت بر روي محيط كشت MS حاوي BA( mg/dm³5/0 (به دست آمد.با انجام واكشت­هاي مكرر شاخساره­هاي به دست آمده از جوانه­هاي جانبي گره، ميزان تكثير با فراواني زياد به دست آمد. شاخساره­هاي طويل شده ، قطع شده ودر محيط پايه MS بدون اكسين ريشه­دار شدند. ريشه­زايي خارج شيشه­اي شاخساره­هاي تشكيل شده درون شيشه با غوطه ور سازي شاخساره­هاي كوچك درون محلولIBA (mg/dm³2 ( به مدت 2 دقيقه انجام شد. استقرار موفقيت آميز در زمين زراعي و زنده ماني زيادگياهان (80- %90) مشاهده شد.

 

2-1-2- باززايي غيرمستقيم در یونجه

مطالعات كشت بافت مربوط به جنين زايي در يونجه در سه گروه زير دسته بندي می‌شود:

-بهبود سيستم كشت همراه با ماتريال گياهي با قابليت باززايي زياد.

-ارزيابي ماتريال گياهي براي قابليت باززايي.

-و اثر متقابل مابين محيط كشت و ماتريال گياهي.

به منظور استفاده از يك سيستم كشت براي اصلاح كاربردي، بهبود يك روش كشت ساده‌تر و يك سيستم براي ارزيابي پاسخ ژنوتيپ ها به تكثير در مقياس بزرگ‌تر، ضروري می‌باشد.

جنين زايي سوماتيكي يك روش اميدبخش بوده واز نظر اقتصادي براي كلون كردناكثرگونه‌های گياهي مهم می‌باشد. اگرچه اين روش براي تعداد زيادي از محصولات باارزش به كار می‌رود، اما هنوز وجود مشكلات متعددي، استفاده گسترده از آن را محدود می‌کند. سرعت پايين جوانه زني و باززايي طولاني مدت جنین‌های سوماتيكي به گياهچه­هاي نرمال، از جمله مشكلات بحراني مهم بوده كه كاربرد تجاري آن را محدود می‌کند (لاي[38]وهمكاران،1995 ).

يونجه از جمله محصولاتي است كه از نقطه نظر توليد جنين از طريق كشت بافت زياد مطالعه شده است) چنوهمكاران،2000(. باززايي گياهان از كشت­هاي سوسپانسيوني و كالوس براي كاربرد صحيح وآسان از تنوع سوماكلونيو برنامه­هاي اصلاح تكاملي موجود براي اصلاح محصولات زراعي ضروري می‌باشد. توانايي باززايي گياهان از گونه‌ای به گونه ديگر، از رقمي به رقم ديگر و از گياهي به گياه ديگر تغيير می‌یابد. همچنين باززايي تحت تاثير فاكتور­هاي متعدد ديگري از جمله ماده تلقيح، سن و سلامتي گياه بخشنده، وفاكتورهاي محيطي مانند درجه حرارت وروشنايي و تركيب محيط كشت به ويژه تركيب تنظيم كننده هاي­رشد می‌باشد ) پيريك[39]، 1987).در باززايي كلي كه به وسيله ريز ازديادي می‌تواند صورت بگيرد، هر ارگان بافتي از طريق تكثير غيرجنسي كشت مريستم­ها وجنين­زايي ويا ارگان­زايي از سلول‌های بي شكل(کشت‌های سوسپانسيوني، پرتوپلاست وكالوس)، نگهداري می‌شود. يونجه به عنوان گونه­هاي مطرح شده با سيستم بذر مصنوعي بسيار پيشرفته می‌باشد، هر چنداستفاده از آن به منظور اهداف تكثير تجارتي هنوزدر حال ارزيابي می‌باشد(پيكيونيوهمكاران[40]،1997(. علاوه بر اين روش­هاي مهمي با استفاده ازروش‌های مهندسي ژنتيك براي بهبود ارزش تغذیه‌ای (Schroeder et al., 1991)، افزايش تحمل به تنش‌های غيرزيستي (Mckersei et al., 1993)، واستفاده از يونجه به عنوان يك منبع توليد محصولات با ارزش افزوده ايجاد شده است.

مطالعات انجام شده در يونجه حاكي از آن است كه كالوس­زايي و باززايي تحت تاثير عوامل ژنوتيپ،محيط كشت و ريزنمونه می‌باشد (Safarnejad,1996). درمطالعه ميزان باززايي در محیط‌های مختلف به طور كلي وجود تنش نقش بازدارنده در عمل باززايي را ايفا می‌کند.Medicago orbicularis بيشترين پتانسيل را در تشكيل كالوس در همه ريزنمونه­ها، محیط‌های كشت و شرايط آزمايشي نشان داد. محيط كشت B5 غني شده با 2.4-D 1mg/l براي كالزاييMedicago orbicularis در هر دو شرايط مطالعه شده (تاريكي و روشنايي) بهترين محيط تعيين شد.يك همبستگي مثبت مابين اندازه كوچك ژنوم Medicago orbicularis و پاسخ خوب به كشت بافت درون شيشه­اي يافته شد.اولين پروتكل برای باززايي گونه يكساله M.truncatula از طريق جنين­زايي سوماتيكي غير مستقيم توسط نولان[41]و همكاران در سال 1989 بهدست آمد و گزارشات كمي از آن زمان منتشر شده است. پروتكل­هاي مشابهي نيز براي باززايي ديگر گونه­هاي يكساله از جمله درM .polymorpha،M .littoralis ،M .suffruticosaو M. lupulina ارائه شد.

يك روش مؤثر براي باززايي درون شيشه­ايM. coerulea از طريق جنين­زايي سوماتيكي غير مستقيم با استفاده از ريزنمونه­هاي مختلف توسط اسوتوسلاووا[42]وهمكاران در سال 2005 طراحي شد. بافت كالوسي با قابليت باززايي از منبع ريزنمونه برگ، برگچه، ساقه و ريشه، با مقدار خوب در محيط كشت MS ويا SH حاوي mg/l2/0BAPو 2,4-Dدر دو غلظتmg/l 4و2 تشكيل شد. ريزنمونه برگچه كه به عنوان ريزنمونه اوليه استفاده شد، بهترين پاسخ مورفوژنتيكي را نشان داد.

در مطالعه­اي توسط زارع وهمكاران در سال 2009، ارزيابي باززايي درون شيشه­اي ارقام يونجه ايراني و انتخاب ژنوتيپهايي با بالاترين ظرفيت باززايي صورت گرفت. پاسخ به جنين­زايي سوماتيكي در برگ و دمبرگ از 5 رقم زراعي و بومي با استفاده از 6 پروتكل باززايي مطالعه شد. نتايج تشكيل كالوس وجنين­زايي وجود تفاوت مابين ودرون ارقام را نشان داد. فراواني جنين­زايي و تعداد جنين در هر كالوس تحت تاثير ژنوتيپ وقطعات ريزنمونه بود. تفاوت معني­داري مابينقطعات برگ و دمبرگ از نظر جنين­زايي مشاهده نشد، ولي تعداد جنين­هاي ايجاد شده توسط برگ به طور معني داري بزرگ‌تر از دمبرگ بود. در ارقام مطالعه شده، ژنوتيپ­هاي جنين­زا در محدوده 0تا 5/18% قرار داشتند. 14 ژنوتيپ ازكل 133 ژنوتيپ جنين­هاي سوماتيكي توليد كردند. سه تا از آن‌ها بالاترين ظرفيت باززايي را نشان دادند. كارآيي تبديل جنين­ها به طور معني­داري تحت تاثير محيط كشت مورد استفاده براي تبديل جنين بود. به طور ميانگين، 62 % جنين­هاي ژنوتيپ­هاي انتخابي، در محيط كشت MMS هم شاخساره و هم ريشه توليد كردند.

كاﺋو[43]وهمكاران در سال 1981 كشت سوسپانسيون سلولي ريزنمونه نوك شاخساره 9گياه يونجه را انجام دادند. براساس نتايج بهدست آمده از نتايج آن‌ها شرايط تغذيه­اي متفاوت و قابل توجهي براي القاء جنين­زايي در كشت­هاي سلولي مشتق شده از اين گياهان ضروري بود. با تنظيم مناسب سطوح هورموني و تركيب نمك­هاي معدني القاء جنين ­زايي در تمام 9 رقم آزمايشي امكان پذير شد. جنين­هاي 7 رقم از 9 رقم زراعي توانايي تبديل به گياه را دارا بودند.القاء كالوس با قابليت جنين­زايي سوماتيكي بر روي دو محيط كشت القاء كالوس، B₅h و SH₄K توسط تيان[44] و همكاران در سال 2002 در يونجه انجام گرفت. جنين­ها بر روي كالوس­هاي القاء شده در محيط كشت B₅h در زماني كه هنوز بر روي محيط القاء كالوس بودند تشكيل شدند، در حالي كه نتوانستند بر روي كالوس­هاي القاء شده در محيط كشت SH₄K تا زماني كه به محيط عاري از مواد تنظيم كننده رشد انتقال يابند، تشكيل شوند.كالوس­هاي القاء شده و رشد يافته در محيط كشت B₅h، قابليتجنين­زايي را در طول واكشت به سرعت از دست دادند، در حالي كه كالوس­هاي القاء شده و رشد يافته در محيط كشت SH₄K، قابليت جنين­زايي را حفظ كردند. جنين­هاي القاء شده بر روي محيط كشت SH₄K رشد سريعي را نشان دادند. گياهان نرمال و كاملا بارور از جنين­هاي رشد يافته از كالوس بر روي محيط كشت SH₄K به دست آمد.

پروتكل كشت ساده­ای به منظور بررسي ژنوتيپهايي با قابليت باززايي توسط تاكاميزو[45]و همكاران در يك رقم سرسخت يونجه (Medicago sativa L.) در سال 1990 گسترش داده شد.26 رقم زراعي و يا نمونه­هاي ژرم پلاسمي به منظور بررسي قابليت آن‌ها براي جنين­زايي سوماتيكي آزمايش شدند. فراواني جنين­زايي سوماتيكي 3 رقم ژاپني كاملا پايين (2%-0) بود و بنابراين به عنوان ارقام سرسخت مورد توجه قرار گرفتند. 4 محيط كشت (B₂, B₅h, UM, SH) به منظور بررسي قابلیتشان براي القاء جنين­زايي سوماتيكي با يكديگر مقايسه شدند. جنين­زايي سوماتيكي تنها در محيط كشت UM اتفاق افتاد. داكيو[46] و همكاران در سال 2006، توانستند شرايط باززايي گياهان را از طريق جنين­زايي سوماتيكي از كشت­هاي سوسپانسيون سلولي از M. truncatula رقم Jemalong لاين M9-10a برقرار كنند.اينچوا[47] و همكاران نيز در سال 2001و 2005، كشت­هاي سوسپانسيون سلولي را با استفاده از ريزنمونه­هاي برگ و ريشه M. truncatula- R108-1و M. truncatula-Jemalong (حاصل از جمع آوري بذور) انجامدادند.

ژنوتيپ فاكتور خيلي مهم در توانايي پاسخ به جنين­زايي می‌باشد. تغيير پذيري در القاء و فراواني جنین‌های حاصل، در ميان گونه­هاي مختلفي از جنس Medicago و درون ارقام مشاهده شده است )چنوهمكاران،;1987 براون[48]وهمكاران،(1985. تفاوت­هاي قابل توجهي نيز در قابليت جنين­زايي مابين جمعيت­هاي يك رقم يا گونه مشاهده شده است.قابليت جنين­زايي وابسته به ژنوتيپ به طور وسيع به ويژه در M. sativa توسط كريس[49]و همكاران(1988)، ميتن[50]و همكاران(1984)، چن و همكاران (1987)، نگرادجان[51]و همكاران(1986)، باربولوا[52]و همكاران(2002) واينچواو همكاران (1994) گزارش شده است. پاسخ مناسب يونجه­هاي يكسالهبا اندازه ژنومي كوچك نسبت به محيط كشت درون شیشه‌ای چه در القاء كالوس و جنين زايي و چه در باززايي مستقيم گزارش شده است. انتخاب ريزنمونه فاكتور مهمي است كه موفقيت در ايجاد پروتوكل جنين­زايي را تعيين مي­كند. علاوه بر اين، باززايي جنين سوماتيكي از منشاء مختلف ريزنمونه در گونه­هاي چند­ساله و يكساله Medicago حاصل شده است. جنين­زايي سوماتيكي غيرمستقيم در M.sativa از ريزنمونه­هاي زيادي مانند برگ(Meijer et al. 1987; Barbulova et al. 2002) ، برگچه et al.1994),(Lai، ميان گره(Parrott et al. 1993), ، جنين نارسNinkovic et al. 1995),، هيپوكتيل (Meijer et al.1987; Kim et al. 2004)، كشت سوسپانسيوني وپروتوپلاست مزوفيل (Atanassov et al.1984). القاء
شده است.

براي گونه­هاي چند­ساله، تشكيل مستقيم جنين از جنين­هاي نابالغ (Maheswaran et al. 1984) و از برگ‌ها در M. falcataگزارش شده است (.(Denchev et al. 1991گل آذين نابالغ يك منبع ريزنمونه مناسب براي تشكيل جنين در M. lupulina(Li et al. 1995). مي­باشد.ريزنمونه­هاي حاوي نواحي فعال مريستماتيكي مانند هيپوكتيل، كوتيلودون، برگچه و قطعات گره ساقه به منظور تشكيل جنين به طور مستقيم در M. truncatula، M. littoralis, M. murex , M. polymorpha مورد استفاده قرار گرفته است. (Iantcheva et al. 1999).. تشكيل مستقيم جنين از ريزنمونه ريشه در M. truncatula گزارش شده است.(Iantcheva et al. 2005)

سن ريزنمونه، اندازه، آماده سازي و محيط كشت مهم‌ترین فاكتور براي تعيين نوع جنين­زايي سوماتيكي )مستقيم يا غيرمستقيم( می‌باشند. سن گياه درون شيشه و مرحله فيزيولوژيكي براي القاء جنين­زايي سوماتيكي بسيار مهم می‌باشد.در يك سيستم جنين­زايي سوماتيكي (در محيط كشت مايع) M. falcata (Denchev et al. 1991) و M. truncatula(Iantcheva et al. 2001),، ريزنمونه­هاي برگي از گياهان درون شيشه­اي 30 روزه جدا شدند. ريزنمونه­ها به وسيله تيغهاسكالپل به قطعات كوچك به اندازهmm 2-4بريده شدند. چنين آماده سازي ريزنمونه با زخم­هاي متعدد و اندازه كوچك، به همراه شرايط كشت مايع و ايجاد تحرك بر روي شيكر چرخشي (rpm100)، منجر به تشكيل مستقيم جنين بر روي سطح ريزنمونه­ها، با كاهش زمان القاء تا 15الي20 روز شد. جنين­ها در ابتدا بر روي لبه­هاي بريده شده ريزنمونه­ها پديدار شدند. در گياه چند­ساله M. falcata، تشكيل غيرمستقيم جنين زماني كه قطعات برگي بر روي يك محيط كشت جامد با همان تركيب كشت شدند گزارش شد، كه قبلا توسط Denchev و همكاران در سال 1991 گزارش شده بود.

تاكنون، در تمام گزارشات يونجه وگونه­هاي يكساله، القاء جنين­زايي سوماتيكي بر روي محيط كشت­هاي حاوي اكسين D, dichlorophenoxyacetic acid, NAA) -(2,4 به تنهايي يا در تركيب با سيتوكينين انجام شده است.(Sanders et al. 1975; McKersie et al. 1996; Brown et al. 1985) Nolan et al. 1989; Chabaud et al. 1996; Pintos et al. 2002).). تاثير2,4-D بر روي جنين­زايي در لگوم­ها و در گونه­هاي Medicago به خوبي شناخته شده است. (Denchev et al. 1991; Trinh et al. 1998; Zafaret al. 1995)..2,4-D می‌تواند به بالاترين غلظت درون سلولي برسد و معمولا نتيجه آن بيشترين فراواني تشكيل جنين می‌باشد. همچنين غلظت 2,4-Dنقش مهمي در روند تمايز و تمايز زدايي درون شيشه­اي بازي می‌کند.(Denchev et al. 1988)

در مطالعه باربولوا و همكاران (2002)، مشخص گردید كه سطوح ( mg/l 5 يا mg/l 2) 2,4-D، كالوس­هاي خيلي متراكم، نكروتيك و با کم‌ترین جنين­زايي در مقايسه با محيط كشت حاوي (mg/l 12,4-D( و داراي كالوس­هاي سفيد، نرم و با بيشترين جنين­زايي، ايجاد می‌کند. براي اين ارقام، پايين­ترين سطح 2,4-D ، بهترين سطح گزارش شده است.

بر طبق گزارشات ورگانا[53]و همكاران در سال 1990 سطوح بالاي 2,4-D ، در بعضي موارد، مانع تقسيم سلولي شده و سلول­هايي كه قبلا پتانسيل جنين­زايي داشتند، غير فعال می‌کند. بيشترين فراواني تشكيل مستقيم جنين سوماتيكي بر روي محيط كشت مايع و در رقم چند­ساله (Denchev et al. 1991)M. falcataو گونه­هاي يكساله (Iantcheva et al. 2001)M. truncatula وM. Polymorphaدر حضور mg/l42,4-D مشاهده شد. سطوح 2,4-D تا حد mg/l 11 قادر به القاء جنين­زايي سوماتيكي بوده، در حالي­كه سطوح بيشتر از اين سطح مانع القاء می‌شود.افزودن NAA براي القاء جنين­زايي سوماتيكي در تعدادي از گونه­هاي يكساله مانند (Scarpa et al. 1993)M. polymorpha، M. rigidulaو (Ibragimova et al. 1997) M.orbicularisوtruncatula (Nolan et al. 1989).M.ضروري می‌باشد.تاثير سيتوكينين درسيستم­هاي جنين­زايي سوماتيكي به صورت مکرر گزارش شده است. افزايش در توليد بافت كالوسي همراه با تشكيل جنين در M. truncatulaو M. sativa هنگامي كه محيط كشت القاء حاوي BAP باشد، مشاهده شده است (Trinh et al. 1998)

گزارش شده است كه در گونه­هاي يكساله يونجه، سيتوكينين­ها در تركيب با اكسين­ها هورمون­هاي مهمي براي باززايي می‌باشند .(Nolan et al., 1989)دوسسانتوس[54]و همكاران در سال 1983در يك مطالعه هيستولوژيكي، اظهارداشتند كه جنين­هاي سوماتيكي ثانويه در يونجه از سلول‌های اپيدرمي منفرد هيپوكتيل، كوتيلودنها، يا بافت‌های كالوسي ترد به وجود می‌آید، اما مولفين منشاء چند سلولي آن‌ها را در كالوس سازمان يافته تفكيك نكردند.باززايي گياه از كالوس در يونجه (Medicago sativa L.) براي اولين بار توسط ساندرز و بينگهام در سال 1972 گزارش شد. سيستم كشت بافت براي جنين­زايي سوماتيكي در ارتباط با پروسه باززايي توسط بسياري از محققين گسترش داده شده است.

پروسه باززايي منجر به تشكيل جنين­هاي سوماتيكي در يونجه می‌شود كه شامل 2 مرحله مي­باشد. در اولين فاز جنين زايي با افزودن 2,4-D در محيط كشت قبل از انتقال به محيط باززايي می‌باشد. تركيب كينتين با 2,4-D در اولين محيط كشت فراواني تشكيل جنين را افزايش می‌دهد. (saunders et al.,1975, Wan et al., 1988). در دومين فاز جنين­ها در حضور نيتروژن كاهش يافته در محيط كشت باززايي گسترش می‌یابند.(Walker et al., 1981) افزودن انواع مختلف آمينواسيدها به محيط كشت باززايي باعث افزايش تعداد جنين­ها شده و كيفيت آن‌ها را بهبود می‌بخشد(Stuart et al., 1984a) .

والكر[55]و همكاران در سال 1979 اولين محيط كشت مورد استفاده در روش دو مرحله­اي را به دو محيط كشت تقسيم كردند: يك محيط كشت تكثير كالوس حاويNAA و يك محيط كشت القاء جنين سوماتيكي حاوي كينتين و غلظت بالاي 2,4-D . اين پروتكل شامل استفاده از محیط‌های كشت متوالي براي تكثيركالوس، القاء جنين، و باززايي به عنوان پروسه سه مرحله‌ای تعيين شد.

قابليت باززايي 4 رقم يونجه (Medicago sativa L.) توسطزانگ و همكاران در سال 2010 مطالعه شد و اثرات ارقام، منابع ريز نمونه و دستورالعمل­هايمختلف محيط كشت بر روي باززايي با يكديگر مقايسه شد. بيشترين فراواني تشكيل كالوس از ريزنمونه هيپوكتيل با 2/71 % بوده كه بافتي با بيشترين پاسخ نسبت به تحقيقات بعدي سيستم باززايي بود. تشكيل سريع كالوس توانمند و بارور بر روي محيط كشت MS حاوي 2,4-D (mg/l 2(و ZT ( mg/l2/0(در تمام 6 سطح اتفاق افتاد.بيشترين فراواني تشكيل كالوس تا 5/88% افزايش يافت. غلظت موثر در محيط كشت باززايي شاخساره از طريق آزمايش اثر سطوح مختلف هورموني در تمايز و رشد كالوسهاي يونجه تعيين شد. بهترين سطح هورموني در محيط كشت باززايي شاخساره MS حاوي2,4-D(mg/l 2) وBA (mg/l5/1) بوده و فراواني باززايي 8/9% بود.

آتاناسو[56]وبراوندر سال 1984، القاء كالوس از ريزنمونه­هاي كوتيلودن، هيپوكتيل و برگ يونجه را بر روي محيط كشت B₅h كه شامل محيط (Gamborg et al., 1968)B₅ تغيير شكل يافته حاوي mg/l 1 2,4-D ، mg/l Kin 0.2گزارش كردند.والتون[57] و همكاران در سال 1988 ژنوتيپ­هايي از 12 خويشاوند 5 گونه وحشي از جنس مديكاگو را به منظور تشكيل كالوس و جنين­زايي سوماتيكي با استفاده از 2 پروتوكل كشت بافت مورد بررسي قرار دادند. اين گونه­هاي وحشي با دو ژنوتيپ از Medicago sativa. با قابليت باززايي زياد مورد مقايسه قرار گرفتند. جنين­زايي در گونه­هاي وحشي بسيار پايين بود. ژنوتيپهاي گونه­هاي وحشي كه توليد كالوس نمودند، جداسازي شدند. در مطالعات قبلي يونجه اشاره شده است كه جنين­زايي تحت كنترل ژنتيكي می‌باشد. Bingham و Reisch در سال 1980 كنترل ژنتيكي جنين­زايي را در يونجه­هاي ديپلوئيد مورد مطالعه قرار داده و اظهار نمودند كه ايجاد تمايز از كالوس تحت كنترل دو ژن غالب می‌باشد.در تحقيق بركات[58]و همكاران در سال 1993، 9 رقم Medicago sativa و يك رقم M. arborea در 6 محيط كشت مختلف به منظور قابليت آن‌ها براي توليد جنين سوماتيكي و گياهچه از كشت­هاي كالوس مورد مطالعه قرار گرفتند. اثر متقابل ژنوتيپ و محيط كشت بر روي القاء كالوس از ريزنمونه­هاي ريشه، هيپوكتيل و كوتيلودون و جنين­زايي سوماتيكي در مرحله بعدي مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه تعداد جنين­ها به طور معني­داري تحت تاثير رقم و پروتوكل­هاي محيط كشت و اثر متقابل آنها می‌باشد. ارقام پاسخ­هاي متفاوتي را به پروتوكل محيط كشت با توجه به تعداد گياهچه­ها دادند.هيندسون[59] و همكاران در سال 1997، پيش تيمارهاي مختلفي را بر روي جنين­هاي سوماتيكي يونجه Medicago sativa L. به منظور بهبود كيفيت وتبديل جنين مورد مطالعه قرار دادند. 4 ژنوتيپ با قابليت باززايي متفاوت با يكديگر مقايسه شدند.باززايي درون شيشه­اي يونجه معمولا از طريق جنين­زايي سوماتيكيوبه غير­مستقيم اتفاق مي­افتد، بنابراين القاء كالوس يك مرحله ضروري براي انجام دادن اين پروسه می‌باشد، اما فرناندز[60]و همكاران در سال 1989 ژنوتيپ­هايي بدون تشكيل هيچ كالوسي مشاهده نمودند. آن‌ها نتيجه گرفتند كه اين ويژگي تحت كنترل يك ژن منفرد می‌باشد كه ژنوتيپ­هايي به وجود می‌آورد كه قادر به توسعه بافت كالوسي نيستند.

انتخاب ريزنمونه يك فاكتور مهمي است كه موفقيت اغلب آزمايشات كشت بافت را تعيين می‌نماید. در لگومها، برگ‌ها (كومار[61]و همكاران،1994)، كوتيلودنها و برگچه­ها (سناراترا[62]و همكاران، 1995) مناسب‌ترین ريزنمونه­هابراي شروع جنين­زايي سوماتيكي می‌باشند. اطلاعاتي وجود دارد كه نقش مهم محتوياتمحيط كشت از جملهشكر براي تشكيل جنين­زايي سوماتيكي را تاييد می‌کنند.نومن[63]وهمكاران در سال 2004، به بررسي امكان استفاده از كشت ارگان زا براي ارزيابي تحمل به شوري گياهان يونجه زراعي (Medicago sativa L.) نسبت به پاسخ به دست آمده از طريق كشت كالوس پرداختند. براي القاء كالوس و تشكيل شاخساره، محيط كشت موراشيك و اسكوك و B5 تغيير يافته به همراه 2 تنظيم كننده رشد شامل2,4-D و BA به منظور ارزيابي پاسخ كالوس و گياهچه­هاي درون شيشه­اي نسبت به تحمل به شوري مورد استفاده قرار گرفت.

 

[1].Spermatophyta

[2].Angiospermae

[3].Dicotyledon

[4]. Rosales

[5]. Papilionaceae

[6]-Totipotency

[7]-Dedifferentiation

[8]-Redifferentiation

[9]-Competency

[10]= Seedling

[11]= Shoot tip

[12]= Li

[13]= Mehra

[14]= Cheema

Populus [15]=

[16]= Rout

[17]= Gurel

[18]= Gulshan

[19]= Singh

[20]= Sharon

[21]= D’sauza

[22]= Shoot apex

[23]= Nodal stem

[24]= Kulkarni

[25]= Amin

[26]= Gangaprasad

[27]= Goleniowski

[28]= Benniaamin

[29]= Uddin

[30]= Chen

[31]= Srinivasan

[32]= Uranbey

[33]= N⁶-benzylaminopurine

[34]= indole-3-butyric acid

[35]= α-naphthaleneacetic acid

[36]= Mallikarjuna

[37]= N⁶-benzyladenine

[38]= Lai

[39]= Pierik

[40]= Piccioni

[41]= Nolan

[42]= Svetoslavova

[43]= Kao

[44]= Tian

[45]= Takamizo

[46]= Duque

[47]= Iantcheva

[48]= Brown

[49]= Kris

[50]= Mitten

[51]= Nagaradjan

[52]= Barbulova

[53]= Vergana

[54]= Dos Santos

[55]= Walker

[56]= Atanassov

[57]= Walton

[58]= Barakat

[59]= Hindson

[60]= Fernández

[61]= Kumar

[62]= Senaratna

[63]= Noaman