مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

آزمون الایزا ELISA

مقدمه

ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay یک روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است که امکان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به صورت همزمان فراهم می کند. این روش در ایمونولوژی (ایمنی شناسی) برای تشخیص وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می شود که عموما به عنوان ابزاری تشخیصی در پزشکی و پاتولوژی و همچنین تست کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع کاربرد دارد.

ELISA بر پایه اندازه گیری کمپلکس رنگی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی استوار است. به این ترتیب که نمونه مورد آزمایش با مقدار نامشخصی آنتی ژن روی فاز جامد (معمولا پلیت پلی استیرن) ریخته می شود، سپس آنتی بادی بازیابی اضافه می‌شود تا با آنتی ژن واکنش داده و ترکیبی ایجاد کند. آنتی بادی بازیابی با آنزیم پیوندی کووالانسی برقرار می کند. بین هر مرحله پلیت با محلول پاک کننده ملایمی شسته می شود تا هر پروتئین یا آنتی بادی باقیمانده شسته شود. پیش از آخرین مرحله شستشو، پلیت با اضافه کردن زیر لایه آنزیمی کشت داده می شود و ماده رنگی تولید می‌شود. طول موج رنگ به دست آمده توسط یک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌شود که این طول موج معرف حضور یک آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن و نیز غلظت آن است. در ELISA های قدیمی تر زیرلایه رنگ‌زا به کار گرفته می‌شد در حالیکه در تست های جدیدتر زیرلایه های فلوروژنیک با حساسیت بسیار بالاتر مورد استفاده قرار می گیرد.

امروزه ELISA یکی از قدرتمند ترین روش های آزمایشگاهی برای پی بردن به اختلالات سیستم ایمنی است، این تست به منظور پی بردن به آنتی‌ژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن یا مواد غیر نرمالی که معرف برخی بیماری‌ها است انجام می شود. همچنین آنتی بادی‌هایی که در پاسخ به برخی عفونت‌ها یا بیماری‌ها به‌وجود آمده نیز توسط این تست قابل تشخیص هستند. تست ELISA اولین آزمایش متداول در غربال‌زنی HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقیق شده و به صفحه ای که حاوی آنتی‌ژن HIV است اضافه می‌شود. اگر آنتی بادی HIV در سرم وجود داشته باشد، به این آنتی‌ژن های HIV می چسبد. سپس به منظور از بین بردن دیگر اجزا سرم، پلیت شستشو داده می شود. یک "آنتی بادی ثانویه" ساخته شده مخصوص (یک آنتی بادی چسبیده به آنتی بادی دیگری) به پلیت اعمال شده و شستشوی دیگری انجام می‌شود. این آنتی بادی ثانویه به صورت شیمیایی به آنزیم از پیش تهیه شده می‌چسبد. این‌بار زیر لایه ای برای آنزیم اعمال شده و توسط آنزیم کاتالیز می‌شود که منجر به تغییر رنگ در فلورسانس می شود.

نتایج ELISA به صورت عددی گزارش می‌شود. بحث‌انگیزترین وجه این تست تعیین نقطه برش بین نتایج مثبت و منفی است.

علاوه بر آزمایش HIV از ELISA برای آزمایش بیماری‌هایی چون هپاتیت، تب استخوان‌شکن، leptospirosis ، عفونت انگلی، تبخال، سرخجه و دیگر عفونت‌های ویروسی و باکتریایی استفاده می‌شود.

پیش از پیدایش روش ELISA ، تنها گزینه برای انجام سنجش ایمنی، ایمنی سنجی رادیویی بود، که از آنتی ژن ها و آنتی بادی هایی که به صورت رادیواکتیو ممیز شده بودند استفاده می‌شد. در این روش در صورت وجود آنتی بادی یا آنتی‌ژنی خاص، رادیواکتیویته سیگنالی تولید می‌کرد. تئوری روش ایمنی سنجی رادیویی اولین بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجایی‌که رادیواکتیویته خطرات زیستی داشت، پیشنهاد امن تر و ایمن تری مبنی بر جایگزینی سیگنال های غیر رادیو اکتیو به جای سیگنال های رادیو اکتیو ارائه شد. وقتی یک آنزیم مشخص (مانند پر اکسیداز) با زیر لایه مناسب واکنش می دهد، منجر به تغییر رنگ آن می‌شود که می تواند به عنوان سیگنال استفاده شود. البته باید تناسب بین سیگنال و وجود آنتی‌بادی یا آنتی ژن تعیین می‌شد که این پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط Wide و Porath این روش تکمیل تر شد. و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهایتا به روش ELISA به شیوه امروزی دست پیدا کردند. ELISA امروزی مزایای زیادی نسبت به روش‌های ایمنی سنجی رادیویی دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امکان اتوماسیون، امکان افزایش حساسیت روش، عمر طولانی کیت های آنزیمی، سرعت خوانش بالا و قیمت ارزان‌تر دستگاه‌ها و معرف ها.

 

ست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بكار می برند بدین ترتیب كه یكی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بكار گرفته می شود، اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای كه مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به هم گرایش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند میتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتین به لیگاند مربوطه اش یا مولكول به گیرنده اختصاصی اش) البته این پدیده یعنی اتصال بین دو ماده ای كه آنتی بادی و آنتی ژن نیستند اما گرایش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرین است و برای بالا بردن حساسیت و اختصاصیت اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن در الایزا باید این اتصالات ناخواسته را به طریقی مهار كرده و یا كارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت. 1 ) تست الیزا برای جستجوی آنتی ژن: ELISA روش بسیار حساسی است که (معمولا) برای جستجوی آنتی ژن یا آنتی بادی بکار میرود در تحت شرایط تنظیم شده (از نظر غلظت یونی و pH) پروتئین ها (آنتی ژن یا آنتی بادی) به طور خودبخود تمایل دارند که به بستر جامد (در این تست plate هایی از جنس پلی استیرن) متصل شوند، ماهیت این اتصال بخوبی معلوم نشده است اما برگشت پذیر بوده و با استفاده از pH های بالاتر یا پایین تر و استفاده از غلظت های یونی بالا اتصال قطع میشود این نوع اتصال خودبخودی اگر چه ظرفیت محدودی دارد ولی با بكارگیری سیستم های تقویتی مناسبی مثل سیستم آنزیم-سوبسترا این اتصالات وسیله بسیار خوبی برای طراحی سیستم الایزا گردیده است. برای انجام الایزا: 1 ) ابتدا باید پروتئین مورد نظر را به كف پلیت چسباند. 2 ) نقاط اتصال باقی مانده را باید با محلول پروتئینی مناسب مسدود كرد. 3 ) محلول مورد آزمایش را اضافه كرد تا دو ماده همدیگر را پیدا كرده و متصل شوند 4 ) سیستم های تقویتی اولیه را برای افزایش حساسیت آزمایش بكار گرفت 5 ) سیستم آنزیمی نهایی را به راه انداخته و رنگ نهایی تولید شده را اندازه گرفت حال این 5 مرحله به تفكیك توضیح داده می شوند: 1 ) اتصال پروتئین به كف پلیت (Coating): آنتی ژن (یا آنتی بادی) در مقادیری در حدود میکروگرم به داخل چاهک پلیت الایزا اضافه شده و فرصت داده میشود تا به مقدار کافی به کف چاهك (well) متصل شود برای اینكار بسته به نوع پروتئین بافرهای مختلفی به كار گرفته می شود و غلظت پروتئین نیز باید مناسب سازی شود در مقادیر بسیار پایین حساسیت ردیابی پایین می آید و در مقادیر بالای آنتی ژن اتصالات سستی نیز برقرار میشود كه در مراحل بعدی كنده شده و هنگام شستشو آنتی ژن همراه با آنتی بادی اختصاصی دفع می شوند و لذا حساسیت تست مجددا پایین می آید. بطور كلی این مرحله اساسی بوده و نقش زیادی در نتیجه نهایی دارد ایده آل های مورد انتظار برای این مرحله اینها هستند: الف) مقدار آنتی ژن متصل شده به كف همه چاهك های یك پلیت باید یكنواخت باشند و كمترین واریانس را در نتیجه ایجاد كنند، بدین معنی كه وقتی یك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمایش كنیم باید نتایج بدست آمده به هم نزدیك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنین اگر آزمایش مورد نظر در حجم بالا انجام میگیرد و چند پلیت را هم زمان كوت نموده و استفاده میكنیم باید جنس پلیت ها و شركت تهیه كننده آنها یكسان باشد تا از خطای مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پلیت ها جلوگیری شود و ترجیحا بافر كوتینگ و زمان كوتینگ و محلول آنتی ژنی آماده شده برای كوتینگ بهتر است یكسان باشند. ب) اتصالات برقرار شده بین آنتی ژن و بستر جامد باید به اندازه كافی محكم و قوی باشند تا در مراحل شستشوی بعدی كنده نشوند، معمولا برای آنتی ژن های عادی، اتصال دهنده اضافی لازم نیست ولی اگر آنتی ژنی استثنائاً با روش معمول به كف پلیت نچسبید یا اتصالات سستی برقرار كرد از مواد و روش های خاصی برای اتصال آنتی ژن به كف بستر استفاده می شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئید یا اشعه ایكس یا ...). ج) پروتئین متصل شده نباید آنقدر كم باشد كه نتواند مقادیر بالای آنتی بادی را جذب كند در این صورت غلظت های بالای آنتی بادی قابل تشخیص نخواهد بود از طرفی پروتئین متصل شده نباید آنقدر زیاد باشد كه اتصالات غیراختصاصی از اتصالات اختصاصی بیشتر شوند كه در این صورت جواب آزمایش قابل اغتماد نخواهد بود برای تامین این سه هدف تمهیدات خاصی به كار گرفته می شوند كه در فرصتی مناسب توضیح داده خواهند شد 2 ) مرحله مسدود سازی یا بلوكینگ (blocking): نقاطی از كف پلیت كه با پروتئین اختصاصی پوشانده نشده اند با استفاده از محلول های پروتئینی خنثی (از این نظر كه در واكنش اختصاصی بعدی اثر سوئی ندارد) پوشانده می شوند محلول های پروتئینی برای این منظور حاوی شیر کم چربی یا آلبومین گاوی یا ژلاتین و یا کازئین میباشند. علاوه بر پروتئین از دترژانت های غیر یونی خاصی نظیر Tween 20 یا Tween 80 یا ... نیز به عنوان كمكی استفاده می شوند نوع این مواد و مقادیر بكار برده شده به صورت تجربی تعیین می شوند و با توجه به تجربیات دیگران می توان محدوده خاصی را برای كار مورد نظر امتحان كرد و بهترین غلظت را بدست آورد (چون پروتئین ها از ریشه های جانبی متفاوتی برخوردارند لذا برای پروتئین های بسیار خالص مثل پروتئین های ریكامبینانت مناسب سازی این تركیبات در بالا بردن اعتبار نتایج بسیار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئین و دترژانت، غلظت یونی بافر بلوك كننده نیز اهمیت زیادی دارد و برای اتصال انتخابی پروتئین مورد نظر (از میان مخلوط پروتئینی) میتوان بافرهای مختلف و غلظت یونی متفاوت را ارزیابی كرده و بهترین بافر را برای آزمایش مورد نظر بدست آورد. 3 ) اتصال آنتی ژن و آنتی بادی محلول مورد آزمایش كه احتمال میرود حاوی مقادیر قابل ردیابی از آنتی بادی بر علیه آنتی ژن اختصاصی موجود در كف پلیت میباشد در این مرحله در بافر مناسبی تهیه شده و اضافه می شود آنتی بادی شناور در محلول، آنتی ژن متصل به بستر را پیدا كرده و به آن متصل می شود بندرت این آنتی بادی متصل به آنزیم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزیمدار در مرحله بعدی بكار گرفته می شود. آنتی بادی های متصل نشده با عمل شستشو از محیط حذف می شوند بافر شستشو معمولا دارای پروتئین خنثی به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. چرا؟ حاوی دترژانت میباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافری مناسب برای اتصال آنتی ژن با آنتی بادی است. آنتی بادی ها، سرم ، و محلولهای بكار گرفته شده در مراحل مختلف الایزا معمولا در بافر شستشو رقیق می شوند. 4 ) سیستم های تقویتی اولیه سیستم تقویتی اولیه قبل از سیستم تقویتی اصلی (كه همانا بكار گرفتن خصوصیت آنزیمهاست) میباشد در این مرحله ما واكنش های اضافه تری را به كار میگیریم تا قدرت اندازه گیری تست (حساسیت و اختصاصیت) بالا برده شود. بدین منظور از قدرت تقویت كنندگی بیوتین-آویدین، بیوتین-استرپتاویدین، لكتین-لیگاند و ... استفاده می شود. 5 ) تقویت آنزیمی هر آنزیمی بر روی سوبسترای اختصاصی خود اثر كرده و آنرا به محصول تبدیل می كند این واكنش در طی زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهی از محصول در محیط می شود بدین معنی كه با گذشت زمان معینی یك مولكول آنزیم می تواند مولكول های سوبسترای بسیاری را به محصول تبدیل كند این اثر افزایشی در حقیقت اساس الایزا را تشكیل میدهد. بدین ترتیب كه آنتی بادی نهایی باقی مانده پس از شستشوی نهایی با مولكول آنزیم متصل است و افزودن سوبسترا در طی زمان معینی (مثلاً یك ساعت) منجر به آزاد سازی مقادیر متنابهی سوبسترا می گردد كه یا خود رنگی میباشد یا در واكنش با ماده دیگری (كروموژن یا رنگزا) كه به محیط اضافه شده است رنگ تولید میكند در نهایت رنگ تولید شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصی خوانده شده و محاسبات لازم بر روی داده های بدست آمده انجام می گیرد اساس تست Sandwich ELISA برای اندازه گیری سیتوکین در روش الایزای ساندویچی مولكول اندازه گیری شده در واقع در بین دو مولكول مختلف آنتی بادی قرار میگیرد (ساندویچ میشود) مثلا این روش را در مورد اندازه گیری سایتوكاین اینترفرون گاما شرح میدهیم: اساس) سلول های طحالی گرفته شده از موش های دریافت کننده واکسن در اثر تحریک با آنتی ژن اختصاصی در محیط کشت تکثیر پیدا خواهند کرد برای تعیین اینکه غالب سلول های تکثیر یابنده از نوع Th1 هستند یا Th2 باید پروفیل سیتوکینی در محیط کشت مشخص شود بدین منظور تعیین مقدار سیتوکین های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محیط کشت مد نظر قرار میگیرد. چنانكه در شكل زیر مشخص شده است در این روش آنتی بادی منوکلونال ضد آنتی ژن به کف plate چسبانده میشود سپس فرصت داده میشود تا آنتی ژن (در این تحقیق سیتوکین IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتی بادی پلی کلونال ضد آنتی ژن اضافه میشود که متصل به آنزیم پراكسیداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ایجاد محصول رنگی میشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت میگردد چون در این روش آنتی ژن در بین دو آنتی بادی قرار میگیرد لذا به ساندویچ مشهور شده است.

 

اساس متد الایزا چیست؟ : اساس متد الایزا بر پایه انتی بادی استوار است در این متد با استفاده از خواص منحصر به فرد انتی بادی شامل قدرت اتصال بالای ان به انتی ژن ( Affinity) و شناسایی دقیق و صحیح انتی ژن (ُSpecificity) بهره گرفته می شود تا بیومولکولهای مورد جستجو شناسایی و اندازه گرفته شوند.در این متد جهت ایجاد سیگنال از انزیم ها و سوبستراهایی که تولید رنگ نمایند استفاده می شود . سپس رنگ ایجاد شده توسط دستگاه مربوطه جذب ان قرائت می گردد.

 

طبقه بندی در الایزا چگونه است؟ : متد الایزا به سه روش کلی تقسیم بندی می گردد که هریک برای منظور خاصی طراحی می گردد این طبقه بندی بدین صورت است 1-ساندویچ الایزا : از این نوع الایزا عمدتا برای تشخیص و اندازه گیری بیومولکولهای پروتیینی استفاده می گردد بیومولکولهایی مانند TSH-LH_FSH-Ferr

 

2-الایزای غیرمستقیم : از این نوع الایزا عمدتا جهت تشخیص و اندازه گیری میزان انتی بادی ضد عوامل عفونی در مایعات بیولوژیک استفاده می گردد بنابر این در این روش از الایزا ما بدنبال انتی بادی ها هستیم انتی بادی هایی نظیر IgA-IgG-IgM

 

3- الایزای رقابتی : بیومولکولهایی که به دو روش فوق قابل شناسایی و سنجش نمی باشند به کمک الایزای رقابتی شناسایی و اندازه گیری می شوند هاپتن ها و مولکولهای پروتیینی بسیار کوچک از این چمله به شمار می روند بیومولکولهایی نظیر تیروکسین-تری یدوتایرونین-استرادیول-کورتیزول

 

اجزا الایزا : در متد الایزا عناصری در کنار یکدیگر قرار می گیرند که واکنش این عناصر با یکدیگر در نهایت منجر به تشخیص و اندازه گیری بیومولکول مورد نظر می گردد در ادامه به معرفی این عناصر خواهیم پرداخت.

 

- میکروپلیت های الایزا : میکروپلیت های الایزا عمدتا شامل 96 میکروول( microwell) می باشند که می تواند در جنس-رنگ-و خواص فیزیکو شیمیایی تنوع زیادی داشته باشند برای مثال جنس این میکروپلیت ها می تواند پلی استایرین -پلی پروپیلن باشند رنگ پلیتها نیز بسته به متد الایزا میتواند شفاف-سیاه-ویا سفید باشد. از خواص فیزیکوشیمیایی این میکروپلیتها می توان به ظرفیت اتصال انها اشاره کرد تقسیم بندی در این مبحث عمدتا به سه دسته پلیتهای با ظرفیت اتصال پایین-پلیتهای با ظرفیت اتصال متوسط-و پلیت های با ظرفیت اتصال بالا تقسیم بندی می گردند از دیگر خواص فیزیکوشیمیایی میکروپلیت های می توان به شکل ظاهری این میکروول ها اشاره کرد که می توانند ته صاف(flat buttom)-ته گرد( round buttom) - و v شکل(V-shaped) باشند. چنین پلیتهایی به پلیتهای خام ( uncoated) معروف هستند.میکروپلیتها در متد الایزا درواقع نقش یک فاز یا محیط جداکننده را بازی می کنند.در متد الایزا بسته به متد بکار رفته بیومولکهای خاصی را در سطح داخلی این میکروول های کوت(coating) می کنند این بیومولکولها می توانند شامل انتی ژنها- انتی بادی ها -هاپتنهای متصل به پروتیین -رسپتورها-و پروتیین ها باشند. کوتینگ این بیومولکولها به سطوح داخلی میکروولهای به دو صورت عمده انجام می شود که شامل کوتینگ به کمک اتصالات غیرکووالانسی و کوتینگ به کمک اتصالات کووالانسی.از مزیتهای کوتینگ به کمک اتصالات کووالانسی می توان به پایین بودن مصرف بیومولکول کوت شونده - عدم تغییر ساختار فضایی بیومولکول کوت شونده-جهت یابی فضایی درست بیومولکولها - محکم بودن اتصالات به پلیت و بالتبع پایداری بسیار بالای میکروپلیت های کوت شده اشاره کرد.

 

استانداردها : در الایزا معمولا از چندین استاندارد استفاده می شود و این از انجا ناشی می شود که رفتار برهم کنش شیمیایی انتی بادی انتی ژن اگر چه وابسته به غلظت است همانند دیگر واکنش های شیمیایی اما دقیقا همانند یک واکنش شیمیایی ساده از یک معادله خطی تبعیت نمی کند که بتوان با داشتن دو استاندارد به معادله ان دست یافت در واقع رفتار برهم کنش اجزا الایزا در یک معادله درجه 2 و بالاتر مطابقت می کند.درچنین حالتی هرچه تعداد نقاط بیشتر باشد شکل درست تری از محنی استاندارد خواهیم داشت.در الایزا از عمدتا 6 استاندارد استفاده می گردد تا بتوان مقادیر پایین - نرمال - و بالا را مورد سنجش قرار داد .ماتریکسی که در ان استاندارد ساخته می شود می بایست تا حد امکان به سرم انسان شبیه باشد در بعضی موارد که ساخت ماتریکس استاندارد به دلایل مختلف ازجمله عدم امکان حذف انالیت مورد جستجودر سرم-وجود مداخله گرهای شناخته شده و شناخته نشده- پرزحمت و پر هزینه بودن استانداردها در ماتریکس های مصنوعی ساخته می شوند و ازانجایی که به ماتریکس سرم انسانی شباهت کامل ندارد می تواند بر میزان یکنواختی-حلالیت-فعالیت انتیژنیک-ساختار کامل فضایی بیومولکول مورد مطالعه اثر بگذارد که می بایست در انتخاب یک ماتریکس مناسب برای استاندارد ها این موارد مد نظر باشد.معمولا جهت ساخت استاندارد از بیومولکولهای بسیار خالص ان که بصورت تجاری در دسترس هستند استفاده می گردد .اگرچه برای بعضی از بیومولکولها استانداردهای بین المللی وجود دارد اما به راحتی دردسترس نیستند-به میزان کافی دردسترس نیستند-به میزان بسیار محدود تولید می شوند و در مورد بعضی بیومولکولها استاندارد بین المللی وجود ندارد.

 

کنژوگه : کنژوگه ها در متد الایزا می تواند به اشکال عمده کنژوگه هاپتن به انزیم و کنژوگه انتی بادی به انزیم و یا کنژوگه اویدین به انزیم باشد.انزیمی که در متد الایزا پرکاربرد شده است HRP(Horse Radish Peroxidase است اما از انزیمهای دیگری مانند الکالین فسفاتاز هم استفاده می شود.از انجا که در کنژوگه ها از انزیم استفاده شده است و انزیم ها بیومولکولهای ناپایداری محسوب می گردند چه ازنظر ساختاری و چه ازنظر فعالیت انزیماتیک بنابر این در برابر عوامل تاثیرگذار حساس هستند عواملی مانند دما-الودگی -و مهارکننده ها.بنابراین پایدار نگه داشتن کنژوگه ها مقوله مهم در بحث کنژوگه ها می باشد.کنژوگه ها را معمولا در محلولهای پایدار کننده که دارای مواد نگه دارنده نیز هستند تهیه می کنند میزان پایداری کنژوگه ها به نوع این محلولهای پایدارکننده و به غلظت این محلولها و به غلظت کنژوگه در این محلولها بستگی دارد البته دمای نگه داری محلولی که کنژوگه در ان تهیه شده است را نباید فراموش کرد.از انجایی که هرچه غلظت کنژوگه در محلول پایدار کننده بیشتر باشد پایداری ان نیز بشتر است بیشتر شرکت های سازنده سعی بر این دارند که کنژوگه ها را بصورت غلیظ 10Xو یا 20X عرضه کنند.

 

سوبسترا و کروموژن : در الایزا چنانچه از انزیم HRP استفاده گردد از پراکسید هیدروژن به عنوان سوبسترا استفاده می گردد که در برابر نور حساس است و به راحتی به طور خودبخود تجزیه می گردد بهمین خاطر ان را در ویالهای تیره نگه داری می کنندو ازانجایی که به محض در اختیار قرار گرفتن برای انزیم به سرعت تجزیه می گردد به عنوان سوبسترای B یعنی سوبسترای دوم تعیین می شود تا میزان رنگ تولید شده متناسب با فعالیت انزیمی باشد.سوبسترای A درواقع ماده رنگزا محسوب می شود این ماده رنگزا برای HRP می تواند TMB-ABTS-و یا OPD باشد .و اگر انزیم در الایزا الکالین فسفاتاز باشد سوبسترای ان p-NPP پارا نیتروفنیل فسفات است که در حضور انزیم فسفات خود را ازدست می دهد و ماده باقی مانده یعنی پارا نیتروفنول که زرد رنگ است به عنوان میزان فعالیت انزیم مورد استفاده قرار میگیرد.درمورد متد الایزا که از انزیم HRP در ان استفاده شده است جداسازی سوبسترا ها به صورت A و B اگرچه میزان پایداری خیلی بالایی را به دست می دهد اما سوبستراهای یک مرحله ای نیز بصورت تجاری موجود هستند که پایداری قابل مقایسه ای دارند. بعضی از این سوبستراهای یک مرحله ای دارای مزیت های افزون تری نیز هستند شامل افزایش شدت رنگ ایجاد شده در مقایسه با سوبستراهای معمولی که منجر به افزایش حساسیت کیت خواهد شد و دیگر اینکه این سوبسترا ها رنگی نیز می باشند که باعث می شود کاربر دچار اشتباه نگردد و یا در دستگاههای اتومات الایزا بتوان برای میزان این ریاجنت سیستم هشدار دهنده طراحی کرد.

 

محلول متوقف کننده : بسته به اینکه جهت بررسی میزان فعالیت انزیم از چه متدی استفاده شود محلول متوقف کننده ممکن است مورد نیاز باشد یا نباشد.به عبارتی دیگر اگر شیوه بررسی فعالیت انزیم کینتیک است به محلول متوقف کننده نیازی نیست و اگر end point است باید استفاده گردد. محلولهای اسیدی مانند HCl و H2SO4 برای توقف فعالیت انزیم HRP و محلول NaOH برای توقف فعالیت انزیم ALP مورد استفاده قرار می گیرد.

 

اصطلاحات

پيش از آغاز اين فصل علامت‌هاي اختصاري رايج را كه بطور گسترده مورد استفاده قرار خواهيم داد مرور مي‌نمائيم.

آنتي‌ژن = Ag

آنتي‌بادي = Ab

آنتي‌بادي اوليه = Ab1

آنتي‌بادي ثانويه = Ab2

آنزيم = E

آنزيم متصل شده به آنتي‌بادي = آنتي‌بادي متصل شده به آنزيم = *E = *Ab

آنتي‌بادي عليه آنتي‌بادي ديگر = Anti – Ab

سوبستراي آنزيم = S

سنجش رنگ بدست آمده با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر = Read

فاز جامد = I

 

انواع روشهاي الايزا

امروزه بر حسب اينكه :

الف) ماهيت آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي مورد سنجش چگونه است و چه هدف كلي از انجام تست الايزا داريم؟

ب) چه مواد و چه واكنشگرهايي در اختيار داريم و يا قادريم تهيه كنيم؟

روشهاي مختلفي از آزمونهاي الايزا طراحي شده و بوفور در كيت‌هاي تشخيص پاتوژنها و در آزمايشهاي تحقيقاتي مورد استفاده قرار مي‌گيرند. اين روشها در زير مورد بررسي قرار مي‌گيرند: (پليت ، كونژوگة مناسب و مادة رنگي مطلوب به سهولت توسط شركت‌هاي تجاري فراهم است.

1- الايزاي مستقيم

الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوشش‌دهي آنتي‌ژن:

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌ژن بر روي پليت‌ها

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر

 

توضيح:

در اين نوع الايزا، آنتي‌ژني كه به ته پليت متصل مي‌شود مستقيما با كونژوگه وارد واكنش مي‌شود. اين نوع روش الايزا، فقط در موارد مشخص استفاده مي‌ شود و آن موردي است كه مي‌ خواهيم بدانيم كه كونژوگه ما براي انجام واكنش مناسب هست يا خير. يعني در اينجا آنتي‌ ژن معمولا IgG مي‌باشد. بنابراين راه اصلي سنجش واكنش يا عدم واكنش كونژوگه‌اي كه عليه يك آنتي‌بادي تهيه شده است ، اين روش مي‌باشد.

تيتر كونژوگه را نيز مي‌توان با استفاده از اين روش الايزا سنجيد. امروزه براي سنجيدن واكنش مونوكلونال آنتي‌بادي كونژوگه شده با يك آنزيم كه برعليه يك آنتي‌ژن خاص مي‌باشد از اين روش استفاده مي‌كنند.

 

الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوشش‌دهي آنتي‌بادي:

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي بادی بر روي پليت‌ها

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر

 

توضيح:

اين نوع روش الايزا نيز فقط در موارد مشخصي استفاده مي‌شود. كلا آنتي‌ژن در موارد بسيار معدودي كونژوگه مي‌شود و استفاده از اين روش بستگي به نوع كار تحقيقاتي دارد.

 

2- الايزاي غير مستقيم

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌ژن

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن آنتي‌بادي (عليه آنتي‌ژن پوشش داده شده) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي ثانوية همراه با آنزيم عليه آنتي‌بادي اوليه) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة ششم: شستشو

مرحلة هفتم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة هشتم: قرائت پليت با الايزاريدر

 

توضيج:

اين روش بسيار رايج مي‌باشد و معمولا براي مشخص نمودن آنتي‌بادي عليه يك پاتوژن خاص يا عليه يك مادة خاص درون سرم از اين روش استفاده مي‌شود. "ويژگي" اندازه‌گيري بستگي به خلوص آنتي‌ژني متصل شده به پليت دارد. در اين روش سرم ما مي‌تواند حاوي آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن باشد (مثلا در افراد مبتلا به بيماري كه بدنشان عليه پروتئين‌هاي آنتی ژنی يک پاتوژن آنتي‌بادي ساخته است) و مي‌تواند آنتي‌بادي عليه آن آنتي‌ژن نداشته باشد (افراد سالم). در اين روش در مراحل اوليه و تنظيم تست الايزا، مي‌توان سرم را با رقت‌هاي مختلف اضافه كرد (سرم را مي‌توانيم با محلول رقيق كنندة سرم رقيق كنيم) و بهترين رقت را در تست‌هاي الايزاي موازي كه فقط رقت سرم آنها متفاوت است بدست آورد. اين روش در كيت‌هاي تجاري تشخيص بيماريها بوفور استفاده مي‌شود. با استفاده از اين روش تيتراسيون كونژوگه نيز انجام مي‌شود.

 

3- الايزاي ساندويچ

الف) ساندويچ مستقيم

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌بادي

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن آنتي‌ژن و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن آنتي‌بادي كونژوگه شده با آنزيم و گذراندن زمان انكوباسيون

 

مرحلة ششم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة هفتم: قرائت پليت توسط الايزاريدر

 

توضيح:

دو آنتي‌بادي كه در اين سيستم بكار مي‌روند مي‌توانند هر دو از يك گونه باشند و يا مي‌توانند از گونه‌هاي متفاوتي از موجودات بدست آيند. گاهي اوقات به آنتي‌ژني كه در اين سيستم بكار مي‌رود آنتي‌ژن تسخير شده يا به دام افتاده مي‌گويند. در اين روش استفاده از محلولهاي بلوكه كننده يا افزودن محلولهاي بلوكه كننده به محلول پوشش‌دهي و محلولهاي شستشو بسيار مهم است.

نكتة مهم در اين روش آنست كه بايد بدانيم كه آنتي‌ژن ما حداقل دو محل اتصال به آنتي‌بادي داشته باشد تا بتواند به اين آنتي‌بادي‌ها متصل شود.

در روش الايزاي ساندويچي مولكول اندازه گيري شده در واقع در بين دو مولكول مختلف آنتي بادي قرار ميگيرد (ساندويچ ميشود) مثلا اين روش را در مورد اندازه گيري سايتوكاين اينترفرون گاما شرح ميدهيم:

اساس) سلول های طحالي گرفته شده از موش های دريافت کننده واکسن در اثر تحريک با آنتي ژن اختصاصي در محيط کشت تکثير پيدا خواهند کرد برای تعيين اينکه غالب سلول های تکثير يابنده از نوع Th1 هستند يا Th2 بايد پروفيل سيتوکيني در محيط کشت مشخص شود بدين منظور تعيين مقدار سيتوکين های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محيط کشت مد نظر قرار ميگيرد.

 

چنانكه در شكل زير مشخص شده است در اين روش آنتي بادی منوکلونال ضد آنتي ژن به کف plate چسبانده ميشود سپس فرصت داده ميشود تا آنتي ژن (در اين تحقيق سيتوکين IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتي بادی پلي کلونال ضد آنتي ژن اضافه ميشود که متصل به آنزيم پراكسيداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ايجاد محصول رنگي ميشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت ميگردد چون در اين روش آنتي ژن در بين دو آنتي بادی قرار ميگيرد لذا به ساندويچ مشهور شده است. تصوير زير گوياي اين شباهت است.

 

ب)ساندويچ غير مستقيم

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌بادي

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن آنتي‌ژن و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن

مرحلة ششم: شستشو

مرحلة هفتم: افزودن آنتي‌بادي سوم كونژوگه شده با آنزيم (عليه آنتي‌بادي دوم)

مرحلة هشتم: شستشو

مرحلة نهم: قرائت پليت توسط الايزاريدر

 

توضيح:

مشخص است كه آنتي‌بادي دوم بايد از يك گونة متفاوت از موجودات تهيه شود.

 

4- الايزاي رقابتي يا مهاري

در روشهاي رقابتي اساس سنجش بر رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي ( كه يكي از آن دو نشاندار است) براي اتصال به ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري يا بالكينگ مي نامند. در روش مهاري ممكن است در بين 2 مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدي شستشو انجام شود يا انجام نشود مثال بارز روشهاي رقابتي و مهارتي سنجش T3,T4 مي باشد. انواع روشهاي رقابتي عبارتند از:

الف) روش رقابتي يا مهاري براي انتي ژن:

اساس اين روش بر رقابت بين آنتي ژن نشاندار و آنتي ژن موجود در نمونه براي اتصال به يك آنتي بادي اختصاصي كوت شده در چاهك استوار است. در اين روش مقدار آنتي بادي كوت شده بايد محدود باشد و ملكول سيگنال دهنده همان آنتي ژن نشاندار است, اساس RIA و EIA كلاسيك به همين روش استوار است

در اين روش منحني پاسخ- دوز به صورت معكوس خواهد بود, بدين معني كه آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادي از آناليت غير نشاتندار موجود در نمونه به مقدار كمتري به آنتي بادي متصل مي شود و در نتيجه سيگنال هم بوجود خوههد آمد.

محدوده تعيين آناليت با اين روش ممكن است بوسيله استفاده از مولكول نشاندار با فعاليت اختصاصي زياد تقويت شود اما حداقل مقدار قابل تشخيص (كمترين مقدار از آناليت كه قابل تشخيص خواهد بود) توسط تمايل ؟آنتي بادي مورد استفاده تعيين مي شود, با اين وجود غلظتهاي خيلي كم از هاپتن ها عموما توسط همين روش قابل تعيين اند و حساس ترين روشي است كه مي تواند مقدار كمتر fmol را هم تشخيص دهد.

در برخي از موارد نشاندار كردن روي خصوصيات هاپتن اثر مي گذارد در نتيجه در روش رقابتي براي تعيين آنتي ژن از يك آنتي بادي نشاندار استفاد مي شود, در اين نوع از سنجش ها اين مطلب ضروري است كه فاز جامد توسط آنتي ژن با مقدار كم و ثابت پوشيده مي شود, در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت كوت شده در چاهك براي اتصال به آنتي بادي نشاندار رقابت مي كند. در اينجا هم منحني استاندار معكوش است, از اين روش بيشتر براي سنجش به روش كمي لومينسانس استفاده مي شود.

ب)روش رقابتي براي آنتي بادي:

دراين روش بين دو آنتي بادي يكي در نمونه به صورت غير نشاندار و يكي به صورت نشاندار شده با آنزيم برا اتصال به يكي آنتي ژن ك.ت شده در چاهك صورت مي پذيرد, بديهي است كه هر چه مقدار آنتي بادي نمونه بيشتر باشد انتب بادي نشاندار كمتري به چاهكها متصل شده و سيگنال نيز كمتر خواهد بود و در نتيجه منحني استاندار نيز معكوس مي باشد و در نتيجه منحني استاندار نيز معكوش مي باشد, شاخص ترين مثال اين روش اندازه گيري آنتب باد بر ضد HBc (HBc Ab) است.

 

تست اليزا برای جستجوی آنتي ژن:

ELISA روش بسيار حساسي است که (معمولا) برای جستجوی آنتي ژن يا آنتي بادی بکار ميرود در تحت شرايط تنظيم شده (از نظر غلظت يوني و pH) پروتئين ها (آنتي ژن يا آنتي بادي) به طور خودبخود تمايل دارند که به بستر جامد (در اين تست plate هايی از جنس پلي استيرن) متصل شوند، ماهيت اين اتصال بخوبي معلوم نشده است اما برگشت پذير بوده و با استفاده از pH هاي بالاتر يا پايين تر و استفاده از غلظت هاي يوني بالا اتصال قطع ميشود اين نوع اتصال خودبخودي اگر چه ظرفيت محدودی دارد ولي با بكارگيري سيستم های تقويتي مناسبي مثل سيستم آنزيم-سوبسترا اين اتصالات وسيله بسيار خوبي برای طراحي سيستم الايزا گرديده است.

براي انجام الايزا:

1 ) ابتدا بايد پروتئين مورد نظر را به كف پليت چسباند.

2 ) نقاط اتصال باقي مانده را بايد با محلول پروتئيني مناسب مسدود كرد.

3 ) محلول مورد آزمايش را اضافه كرد تا دو ماده همديگر را پيدا كرده و متصل شوند

4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه را براي افزايش حساسيت آزمايش بكار گرفت

5 ) سيستم آنزيمي نهايي را به راه انداخته و رنگ نهايي توليد شده را اندازه گرفت

 

حال اين 5 مرحله به تفكيك توضيح داده مي شوند:

1 ) اتصال پروتئين به كف پليت (Coating):

آنتي ژن (يا آنتي بادی) در مقاديری در حدود ميکروگرم به داخل چاهک پليت الايزا اضافه شده و فرصت داده ميشود تا به مقدار کافي به کف چاهك (well) متصل شود براي اينكار بسته به نوع پروتئين بافرهاي مختلفي به كار گرفته مي شود و غلظت پروتئين نيز بايد مناسب سازي شود در مقادير بسيار پايين حساسيت رديابي پايين مي آيد و در مقادير بالاي آنتي ژن اتصالات سستي نيز برقرار ميشود كه در مراحل بعدي كنده شده و هنگام شستشو آنتي ژن همراه با آنتي بادي اختصاصي دفع مي شوند و لذا حساسيت تست مجددا پايين مي آيد.

بطور كلي اين مرحله اساسي بوده و نقش زيادي در نتيجه نهايي دارد ايده آل هاي مورد انتظار براي اين مرحله اينها هستند:

الف) مقدار آنتي ژن متصل شده به كف همه چاهك هاي يك پليت بايد يكنواخت باشند و كمترين واريانس را در نتيجه ايجاد كنند، بدين معني كه وقتي يك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمايش كنيم بايد نتايج بدست آمده به هم نزديك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنين اگر آزمايش مورد نظر در حجم بالا انجام ميگيرد و چند پليت را هم زمان كوت نموده و استفاده ميكنيم بايد جنس پليت ها و شركت تهيه كننده آنها يكسان باشد تا از خطاي مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پليت ها جلوگيري شود و ترجيحا بافر كوتينگ و زمان كوتينگ و محلول آنتي ژني آماده شده براي كوتينگ بهتر است يكسان باشند.

 

ب) اتصالات برقرار شده بين آنتي ژن و بستر جامد بايد به اندازه كافي محكم و قوي باشند تا در مراحل شستشوي بعدي كنده نشوند، معمولا براي آنتي ژن هاي عادي، اتصال دهنده اضافي لازم نيست ولي اگر آنتي ژني استثنائاً با روش معمول به كف پليت نچسبيد يا اتصالات سستي برقرار كرد از مواد و روش هاي خاصي براي اتصال آنتي ژن به كف بستر استفاده مي شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئيد يا اشعه ايكس يا ...).

ج) پروتئين متصل شده نبايد آنقدر كم باشد كه نتواند مقادير بالاي آنتي بادي را جذب كند در اين صورت غلظت هاي بالاي آنتي بادي قابل تشخيص نخواهد بود از طرفي پروتئين متصل شده نبايد آنقدر زياد باشد كه اتصالات غيراختصاصي از اتصالات اختصاصي بيشتر شوند كه در اين صورت جواب آزمايش قابل اغتماد نخواهد بود

براي تامين اين سه هدف تمهيدات خاصي به كار گرفته مي شوند كه در فرصتي مناسب توضيح داده خواهند شد

 

2 ) مرحله مسدود سازي يا بلوكينگ (blocking):

نقاطي از كف پليت كه با پروتئين اختصاصي پوشانده نشده اند با استفاده از محلول هاي پروتئيني خنثي (از اين نظر كه در واكنش اختصاصي بعدي اثر سوئي ندارد) پوشانده مي شوند محلول هاي پروتئيني براي اين منظور حاوي شير کم چربي يا آلبومين گاوی يا ژلاتين و يا کازئين ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت هاي غير يوني خاصي نظير Tween 20 يا Tween 80 يا ... نيز به عنوان كمكي استفاده مي شوند نوع اين مواد و مقادير بكار برده شده به صورت تجربي تعيين مي شوند و با توجه به تجربيات ديگران مي توان محدوده خاصي را براي كار مورد نظر امتحان كرد و بهترين غلظت را بدست آورد (چون پروتئين ها از ريشه هاي جانبي متفاوتي برخوردارند لذا براي پروتئين هاي بسيار خالص مثل پروتئين هاي ريكامبينانت مناسب سازي اين تركيبات در بالا بردن اعتبار نتايج بسيار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يوني بافر بلوك كننده نيز اهميت زيادي دارد و براي اتصال انتخابي پروتئين مورد نظر (از ميان مخلوط پروتئيني) ميتوان بافرهاي مختلف و غلظت يوني متفاوت را ارزيابي كرده و بهترين بافر را براي آزمايش مورد نظر بدست آورد.

 

 

3 ) اتصال آنتي ژن و آنتي بادي

محلول مورد آزمايش كه احتمال ميرود حاوي مقادير قابل رديابي از آنتي بادي بر عليه آنتي ژن اختصاصي موجود در كف پليت ميباشد در اين مرحله در بافر مناسبي تهيه شده و اضافه مي شود آنتي بادي شناور در محلول، آنتي ژن متصل به بستر را پيدا كرده و به آن متصل مي شود بندرت اين آنتي بادي متصل به آنزيم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزيمدار در مرحله بعدي بكار گرفته مي شود.

آنتي بادي هاي متصل نشده با عمل شستشو از محيط حذف مي شوند بافر شستشو معمولا داراي پروتئين خنثي به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. چرا؟ حاوي دترژانت ميباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافري مناسب براي اتصال آنتي ژن با آنتي بادي است. آنتي بادي ها، سرم ، و محلولهاي بكار گرفته شده در مراحل مختلف الايزا معمولا در بافر شستشو رقيق مي شوند.

 

4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه

سيستم تقويتي اوليه قبل از سيستم تقويتي اصلي (كه همانا بكار گرفتن خصوصيت آنزيمهاست) ميباشد در اين مرحله ما واكنش هاي اضافه تري را به كار ميگيريم تا قدرت اندازه گيري تست (حساسيت و اختصاصيت) بالا برده شود.

بدين منظور از قدرت تقويت كنندگي بيوتين-آويدين، بيوتين-استرپتاويدين، لكتين-ليگاند و ... استفاده مي شود.

 

5 ) تقويت آنزيمي

هر آنزيمي بر روي سوبستراي اختصاصي خود اثر كرده و آنرا به محصول تبديل مي كند اين واكنش در طي زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهي از محصول در محيط مي شود بدين معني كه با گذشت زمان معيني يك مولكول آنزيم مي تواند مولكول هاي سوبستراي بسياري را به محصول تبديل كند اين اثر افزايشي در حقيقت اساس الايزا را تشكيل ميدهد. بدين ترتيب كه آنتي بادي نهايي باقي مانده پس از شستشوي نهايي با مولكول آنزيم متصل است و افزودن سوبسترا در طي زمان معيني (مثلاً يك ساعت) منجر به آزاد سازي مقادير متنابهي سوبسترا مي گردد كه يا خود رنگي ميباشد يا در واكنش با ماده ديگري (كروموژن يا رنگزا) كه به محيط اضافه شده است رنگ توليد ميكند در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصي خوانده شده و محاسبات لازم بر روي داده هاي بدست آمده انجام مي گيرد.

 

در شكل بالا پروتئين rgp63 به كف چاهك متصل شده است (مرحله 1)، بعد از مسدودسازي نقاط باقي مانده (مرحله 2) محلول مجهول اضافه شده است و آنتي بادي اختصاصي شناسايي كننده آنتي ژن (موجود در محلول) به آنتي ژن متصل شده و بقيه محلول با عمل شستشو از محيط حذف شده است (مرحله 3). سپس آنتي بادي ضد آنتي بادي اول كه با آنزيم گونژوگه شده اضافه شده است (مرحله 4). پس از شستشو و حذف مولكول هاي آنزيم دار متصل نشده سوبسترا و كروموژن اضافه شده است در اثر آنزيم باقي مانده در چاهك ماده آبي رنگ حاصل شده است ميتوان آن را قرائت كرد در مورد برخي سوبستراها با افزودن محلول هاي ديگري رنگ ايجاد شده را هم تقويت نموده و هم تثبيت ميكنند تا نتايج بهتري اخذ شوند (مرحله 5).

 

شرح مراحل انجام یک آزمون الایزا

براي انجام تست ELISA بايد نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. براي اين كار بايد به مواردي دقت داشت. مثلا از بستن گارو براي مدتي طولاني بايد اجتناب كرد چرا كه ممكن است در پارامترهاي مورد اندازه گيري تاثير گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازي سرم نيز بايد دقت شود كه فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد. پيش از انجام آزمايش بايد به كيفيت كيت هاي مورد مصرف توجه كرد، همچنين نگهداري آن‌ها بايد در دماي­C 8-2 صورت گيرد. تمامي محلول‌هاي موجود در كيت قبل از مصرف بايدخوب مخلوط شده و به دماي آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزايش پايداري، بلافاصله اجزاء كيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيري كرد. ايجاد پديده هوك باعث ايجاد نتايج پايين كاذب مي‌شود لذا توصيه مي‌شود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يك دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود. از آنجا كه فريز و ديفريز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخي از هورمون ها مي‌شود، بايد تا حد ممكن از اين كار پرهيز شود. پيش از اندازه گيري بايد كليه ابزارهاي مورد استفاده اعم از نوك ابزار نمونه‌گيري و كيت ها استريل شوند. كه البته استفاده از ابزارهاي يكبار مصرف پيشنهاد مي‌شود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش هاي شيشه‌اي آن‌ها را با اسيد سولفوريك رقيق شستشو داده و با آب مقطري كه دوبار تقطير شده آبكشي انجام داد. از به كار بردن محلول‌هاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد پرهيز كرد. ضمنا بايد از كاركرد صحيح دستگاه‌ها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فيلترهاي خواننده ELISA به كمك استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بيكرومات پتاسيم يا عملكردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان حاصل كرد.

1- فاز جامد

امروزه بیشتر از پلیت‌های 96 خانه‌ای بعنوان فاز جامد استفاده می‌شود. انواع انعطاف‌پذیر و جداشدنی از پلی‌وینیل كراید و انواع سخت و محكم از پلی‌استیرن ساخته می‌شوند. هم ‌اكنون شركت‌های معتبر و متعددی به‌ساخت انواع مختلف پلیت‌های الایزا مشغول هستند دربعضی از انواع این پلیت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می‌باشند.

بعضی از پلیت‌ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می‌باشند. امروزه آزمایشهای متعددی با موفقیت با هر كدام از این نوع پلیت‌ها انجام می‌شود و نمی‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت‌ها دارد. می‌توان با انجام دو آزمایش الایزای كاملا یكسان كه تنها در نوع پلیت متفاوتند و بررسی نتایج تشخیص داد كه برای كدام نوع از آنتی‌ژن، كدام پلیت بهتر است. بطور كلی پلیت‌هایی كه انتهای چاهك‌های آنها تخت می‌باشد توصیه می‌شود.

 

2- پوشش‌دهی

این مرحله كه یكی از مهمترین مراحل آزمون الایزا می‌باشد عبارتست از اتصال پروتئین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر روی پلیت ,درون چاهك‌ های یك پلیت 96 خانه‌ای, كه عمدتا براساس واكنش‌ های آبگریز مابین ماتریكس پلاستیكی و پروتئین می‌باشد. بنابراین هر پروتئین یك ثابت اتصال متفاوتی با پلیت‌ها دارد. این واكنش بستگی به بار خالص پروتئین ندارد.

بناب