مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

انواع محیط کشت

معرفي محيط كشت و انواع آن

مجموعه اي از پروتئين ،چربي و هر چيزي كه ميكروب به آن احتياج داردرا محيط كشت مي گويند .براي رشد ميكرو ارگانيسم ها حتما بايد دما ،رطوبت و مواد غذايي مناسب دراختيار آنها قرار گيرد.محيط كشت تامين كننده ي تمام مواد غذايي مورد نياز ميكرو ارگانيسم است.اين محيط يك تركيب يكنواخت دائمي نيست بلكه بر اساس نوع ميكرو ارگانيسم و اهداف مختلف تغيير ميكند.بر اساس اهداف زير ممكن است نوع محيط كشت تغيير كند.

1- جداسازي و شناسايي يك ميكرو ارگانيسم از نمونه هاي مختلف

2- خالص سازي يك ميكرو ارگانيسم (براي جدا سازي گونه هاي خاصي استفاده مي شود).

3- تشخيص ودرمان(بيشتر در ميكروبيولوژي پزشكي كاربرد دارد)

4- بررسي خصوصيات مورفولوژيك و بيوشيميايي ميكرو ارگانيسم ها (مثلا شكل كلوني يا توليد آنزيمي خاص ،محرك بودن يا نبودن،مواد توليد كننده مثل گاز يا اسيد)

5- تهيه آنتي ژن ها از محيط كشت خاص (براي مثال از محيط كشت تريپتوز براث براي تجزيه ي آمينو اسيد تريپتوفان توسط آنزيم تريپتوفاز( ي) كه باكتري توليد ميكند استفاده ميكنيم.

تقسيم بندي محيط هاي كشت:

A-از نظر حالت فيزيكي:

1-محيط كشت جامد:در اين محيط علاوه بر تر كيبات غذايي كه در هر محيط كشت وجود دارد،تركيبي يه نام آگار وجود دارد.منظور از تر كيبات غذايي تركيباتي است كه تامين كننده ي نياز غذايي ميكرو ارگانيسم است.بدين شكل كه هر ميكرو ارگانيسم براي ساختن و متابوليسم سلولي نياز به منابع مختلفي از عناصر سازنده ي خود دارد.مانند منابع:كربن، گوگرد، نيتروژن، فسفر،پتاسيم ،اكسيژن،هيدروژن و... در ضمن اگر ميكرو ارگانيسمي نتواند ماده اي را بسازد بايد آن ماده را در اختيارش قرار داد.

آگار: پلي ساكاريدي است كه از منابع در ياي تامين ميشودو اگر به ميزان 2-5/1 درصد به محيط كشت اضافه شود، محيط را به حالت جامد در مي آوردچون خاصيت ژله كنندگي دارد .در ابتدا بجاي آگار از نشاسته و ژلا تين استفاده ميشد و چون اين مواد در اثر افزوده شدن به محيط كشت توسط ياكتري مصرف مي شوند و موجب مايع شدن محيط مي شوند،جاي خود را به آگار دادند.

روي ليبل محيط كشت حاوي آگار اين چنين نوشته شده:E.M.B-Agar

2-محيط كشت نيمه جامد:اين محيط كشت به ميزان خيلي كم يعني حدود5/0-3/0 درصد آگار داردبراي اثبات متحرك و يا ثابت بودن باكتري ها از اين محيط كشت استفاده ميكنيم

3-محيط كشت مايع:اين محيط زماني مفيد است كه بخواهيم ميكرو ارگانيسم را در لوله آزمايش توليد كنيم.اين نوع نحيط ها داراي پسوند براث هستند يعني فاقد آگار مي باشند.

B-انواع محيط كشت از نطر ارزش غذايي:

1-محيط كشت حد اقل(minimal media):داراي مواد حد اقلي از تركيبات مورد نياز ميكرو ارگانيسم ها مي باشد.اين محيط كشت حاوي آب،گلوكز،يك تركيب ازت دار و برخي املاح است كه ميكرو ارگانيسم هايي كه از اين اجزاي ساده تمام نياز خود را بر طرف ميكنند بر روي آن رشد ميكنند (مانند محيط كشت پپتون واتر).

2-محيط كشت عمومي (مغذي):محيط هايي كه در آنها مواد غذايي مختلف براي رشد انواع ميكرو ارگانيسم ها فراهم است.يعني طيف وسيعي از آنهابر روي محيط كشت مي توانند رشد و نمو كنند.اين محيط بصورت عمومي و فاقد هر گونه ماده ي باز دارنده و مهار كننده ي رشد ميكرو ارگانيسم هاست.

C-انواع محيط كشت از نظر نحوه ي عملكرد بر روي ميكرو ارگانيسم:

1-محيط كشت اختصاصي يا انتخابي(selective):براي جدا كردن ،شناسايي و تفكيك گروهها يا جنسهاي مشخص از ميكرو ارگانيسم ها مورد استفاده قرار ميگيرد و دو حالت دارد:

a-محيط كشت اختصاصي واجد تركيبات باز دارنده:اين نوع تركيبات از رشد ميكرو ارگانيسم هاي همراه ميكرو ارگانيسم مورد نظر جلوگيري كرده و مانع از رشد آن مي شود.در نتيجه فقط آنهايي رشد ميكنند كه مورد انتخاب ما هستند.(selective media)

b-محيط كشت اختصاصي فاقد مواد باز دارنده :اين نوع محيط كشت تركيبات باز دارنده ندارد ولي مواد غذايي موجود در آن فقط توسط برخي ميكرو ارگانيسم ها قابل مصرف است و بقيه توان استفاده از آن را ندارند و به دليل عدم مصرف مواد غذايي متابوليسم انجام نداده و مي ميرند.در نتيجه فقط ميكرو ارگانيسم هاي مورد نظر ما رشد ميكنند. مثلا ماده اي به نام monitol كه باكتري E.Coli قادر به استفاده از آن نيست.

در محيط هاي كشت اختصاصي معمولا از تركيباتي مانند انديكاتورها استفاده مي شود كه اين تركيبات قادرند پس از رشد ميكرو ارگانيسم ها تمايزي را بين ميكروارگانيسم هاي رشد يافته ايجاد كنند كه بر اساس آن قابل تشخيص شوند.مثلا انديكاتور فنول در محيط اسيدي به رنگ زرد ودرمحيط قليايي به رنگ قرمز در مي آيند.بنابراين اگر ميكرو ارگانيسمي از قند استفاده ميكند،كلوني هايي تشكيل دهد،در مجاورت فنول زرد خواهد شد.

تقريبا تمام گرم مثبت ها به محيط كشتي كه بيش از8% نمك دارد حساسندو گرم منفي ها نيزبه ناليديك اسيد حساسند.

D-انواع محيط كشت از نظر منشا:

1-محيط كشت طبيعي:محيط هايي كه از طريق مواد گياهي يا حيواني و يا تغيير در آنها ايجاد ميشوند. مانند محيط كشتي كه از سيب زميني ،موز و گوجه فرنگي بدست مي آيد.يامحيط كشت هايي كه منبع حيواني دارد مثل تخم مرغ كه محيط كشت ويروس است.

2-محيط كشت مصنوعي(سنتزي):اين نوع محيط كشت همان است كه در آزمايشگاه مورد استفاده قرار ميگيرد و توسط شركت هاي مختلفي من جملهB.B.L ، SIGMA، DIFCO و... ساخته ميشوند.

محيط كشت مصنوعي شامل دو نوع ميباشد:1-گرانوله 2- پودري

اين دو نوع با هم تفاوتهايي دارند كه موجب مزيت گرانوله بر پودري ميشوند:

1-پودري باعث آلرژي مي شود

2-وزنكردن گرانوله راحتتر است

3-پودري به لبه هاي ارلن ميچسبد و كار خطا دارد

4- پودري اگر با آب مخلوط شود حالت كلوخي ميگيرد و حل كردن آن مشكل است

5-عمر گرانوله بيشتر است چون رطوبت كمتري جذب مي كندو تغييراتPH و شيميايي كمتري دارد.در صورتي كه پودري با ايجاد تغييرات شديد PHو شيميايي غير قابل استفاده ميشود.

طرز تهيه ي محيط كشت:

محيط كشت هاي مختلف دستورساخت هاي مختلفي دارند كه بر روي ليبل همه ي آنها بر اساس يك ليتر نوشته شده است.

1-مرحله توزين:بر اساس دستورالعمل پشت بسته عمل كرده و به مقدار مورد نياز از محيط كشت بر مي داريم.

2-انتخاب ظرف مناسب(3-2 برابر حجم كار)

3-ابتدا نصف آب را درون ظرف خالي مي ريزيم سپس محيط كشت را درون ارلن مي ريزيم و باقي مانده ي آب را نيز به ارلن اضافه ميكنيم(روش پودري)(ولي براي گرانوله ترتيب مهم نيست).

4-اگر محيط كشت براث باشد با كمي تكان دادن محيط كاملا حل مي شودو اگر احيانا حل نشد يا كمي كدورت داشت حرارت جزئي به آن داده مي شود.و براي محيط هاي كشت آگاردار كاملا محيط كشت را حرارت مي دهيم تا آگار كاملا حل شود.(دماي بالاي95-92 درجه ي سانتيگراد)

5-در صورتي كه طبق دستورالعمل محيط كشت نياز به اتو كلاو داشته باشداين عمل را انجام ميدهيم.

6-پس از پايان اتوكلاو PH محيط كشت را تنظيم ميكنيم.

توضيح:ابتدا با PHمتر، PHمحيط را اندازه مي گيريم.در صورتي كه اين عدد با عدد مربوط به PH روي ليبل محيط كشت تفاوت داشته باشدبايد براي تنظيم از سود1/0 نرمال و يا اسيد 1/0 نرمال استفاده كرد.(چگونه؟).فرض كنيم PHمحيط طبق دستورالعمل 7 است و PHتهيه شده 6 باشد.بديهي است كه براي تنظيم PHمحيط بايد از سود 1/0 نرمال استفاده كنيم بدين صورت كه اگر بطور مثالcc200محيط كشت تهيه كرده باشيم مقدارcc 10از محيط كشت تهيه شده را بر ميداريم و الكترود PHمتر را درون آقرار مي دهيم و قطره قطره سود1/0 نرمال را به آن مي افزاييم و همزمان به كمك الكترود آن را هم ميزنيم. زماني كه PHمحيط كشت به عدد7 رسيد،اين عمل را متوقف ميكنيم.سپس با يك تناسب گيري مقدار مورد نياز سود را به محيط كشت در شرايط استريل مي افزاييم تا به PH مورد نظر برسيم.

7-صبر ميكنيم تا دماي محيط كشت كه از اتو كلاو بيرون آمدپايين آمده و به حدود 45 درجه ي سانتيگراد برسد.آگار زير 42 درجه ميبندد بنابر اين حتما بايد دمايش بالاتر از 42 درجه سلسيوس باشد.اگر عرق كرده باشد ،محيط كشت را بر عكس كرده و به مدت30-20 دقيقه در اينكو باتور مي گذاريم.

نكات مهم:

1- دو نمونه از پليت ها را درون اينكو باتور قرار داده و 24 ساعت بعد به آن سر بزنيد اگر كلوني اي روي آن رشد نكرده بود،معلوم مي شود كار خود را درست انجام داده ايم.

2- هنگام ريختن محيط كشت درون پليت بايد توجه كنيم كه هوا رفت و آمد نكندبراي اين منظور بهتر است عمل ريختن درون پليت را در هود انجام دهيم.

3- اگر هنگام ريختن محيط در پليت حباب ايجاد شد،بوسيله ي برگرداندن شعله روي حباب آن را از بين مي بريم.

4- تمام مراحل بايد در شرايط استريل انجام شود.

5-در مورد پخش كردن محيط كشت بايد به اين نكته توجه كنيم كه در محيط كشت براث عمل پخش كردن بايد قبل از اتو كلاو صورت گيرد ولي براي محيط كشت جامد بايد اول آن را استريل كنيم سپس درون پليت بريزيم.

6- نگهداري محيط كشت:

a-محيط كشت كشت بايد در جاي خشك، تاريك و در دماي 25-15 درجه ي سانتيگراد نگهداري شود.

b-محيط كشتي كه PH غير اسيدي دارد را مي توان چندين بار روي حرارت قرار دار و آن را باز كرد.در مورد محيط كشت اسيدي ممكن است آگار آن هيدروليز شود.

c-اگر محيط كشت خيلي كهنه باشد يا رطوبت جذب كرده باشد كلو خه مي شود.

d-حرارت بيش از حد،جذب رطوبت و ... سبب تغيير PHمي شود.