مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

آزمايشگاه باكتري شناسي

در تشخيص استافيلوكوك‌ها اين باكتري كوكسي‌هاي گرم مثبت هستند. داراي آنزيم كاتالاز و اكسيداز منفي هستند. حركت منفي هستند. معمولاً بدون كپسول، حرارت رشد ^o46-15 اما بهترين دماي رشد ^o37 است. املاح صفراوي تا 40% تحمل مي‌كنند. اغلب آنها گلوكز را در شرايط هوازي و بي‌هوازي تخمير مي‌كنند. اغلب آنها گلوكز را در شرايط هوازي و بي‌هوازي تخمير مي‌كنند.

تخمير گليسرول در حضور اريترومايسين اغلب تحمل نمك %5/7-5 حتي بعضي‌ها تحمل %15-10 نيز دارند كه بصورت متغير وجود دارند. آرايش تكي، 2تايي، 4تايي، 8 تايي، زنجيره‌اي و بيشتر خوشه‌اي است. قطر كوكسي بين نيم تا 5/3 ميكرون متغير.

پرنياز نيستند و روي نوترين آگار رشد مي‌كنند. كلني آنها روي محيط‌هاي جامد بصورت گرد با كناره‌هاي صاف با اندازه قطر حدود mm5-2 با ساختمان يكنواخت. سطح نيمه محدب تا محدب. بدبو بعضي‌ها بي‌بو و كلاً كلني‌هاي آنها بدليل گرم مثبت بودن كدر و مات است و داراي پيگمانت‌هاي رنگي مثل سفيد، زرد، زرد طلايي، زرد ليمويي، نارنجي و يا زرد مايل به سبز ديده مي‌شود. كلني استاف‌ها با كلني ميكروكوكوس‌ها تفاوت زيادي ندارد.

استافيلوكوك‌ها داراي هموليزين‌هاي متفاوت‌اند. كه قادر به ليز RBCها هستند و معمولاً انواع بيماري‌زاي استاف‌ها هموليز β دارند مثل استاف اورئوس. مثلاً بعد از h24 در 25 تا ^o37 يك هاله شفاف ناشي از هموليز كامل RBCها ظاهر مي‌شود كه در اثر وجود آنزيمي بنام اسفنگوميليناز بطور كامل غشاRBC را ليز مي‌كنند و هموليز بصورت ظاهري با چشم ديده مي‌شود.

Sها مي‌توانند داراي آنزيمي بنام فسفاتاز باشند كه مي‌توان براي مشاهده اين آنزيم آزمايش انجام بدهيم. به اين صورت كه از يك نوع نمك فسفات‌دار مانند فسفات دي سريك يا دي پتاسيك به همراه معرف فنل فتالئين مخلوط كرده و به محيط نوترين آگار يا براس اضافه مي‌كنيم و باكتري را در اين محيط‌ها مي‌توان كشت داد و گرماگذاري مي‌كنيم و بعد از h24 بعد مقداري معرف قليايي مانند سود در سطح محيط روي كلني‌ها اضافه مي‌كنيم و با اين كار مي‌توان وجود آنزيم فسفاتاز را بررسي كنيم.

با تغيير رنگ محيط واگر با ريختن سود رنگ ارغواني فنل فتالئين ظاهر شد نشان دهنده‌ي وجود آنزيم فسفاتاز است. يعني با حضور آنزيم فسفاتاز معرف فنل فتالئين از نمك فسفات‌دار جدا مي‌شود و در محيط رها مي‌شود و در اين حالت با اضافه كردن سود رنگ فنل فتالئين به رنگ ارغواني ظاهر مي‌شود و اگر آنزيم فسفاتاز وجود نداشته باشد حتي با اضافه كردن سود، تغيير رنگي در محيط مشاهده نخواهد شد.

 

آزمايش حساسيت به نئوبيوسين

كه براي اين آزمايش يك ديسك آنتي بيوتيك مذكور را روي كشت يكنواخت و متراكم باكتري مشكوك به S. اورئوس را روي بلاد آگار يا مولر هينتون قرار داده پليت را h24 گرماگذاري مي‌كنيم و اگر باكتري استاف اورئوس باشد بخاطر حساسيت به اين آنتي بيوتيك هاله‌ي عدم رشد در اطراف ديسك بوجود مي‌آيد كه نشان دهنده‌ي مثبت بودن جواب است.

تست كواگولاز به دو روش:

Slicle

Tube

كه علت آن وجود داشتن دو نوع كواگولاز است.

در روش اسلايد يك سوسپانسيون غليظ از باكتري تهيه مي‌شود و روي آن قطره‌اي از پلاسماي نيتراته خرگوش يا انسان را اضافه مي‌كنيم كه در مورد انسان پلاسما بايد به نسبت 1 به 4 رقيق شود. لام حاوي اين دو مخلوط را بصورت دوراني تكان مي‌دهيم و اگر بعد از مدت كوتاهي لخته فيبريني مشاهده شد، دليل بر وجود آنزيم كواگولاز است. در بعضي از مواقع ممكن است باكتري آنزيم كواگولاز ضعيف داشته باشد. اگر ضعيف باشد در اين حالت سريعاً عمل نمي‌كند و بايد بدنبال انواع ديگر آزمايش‌ها باشيم. كه در اين مواقع معمولاً از روش تيوب استفاده مي‌كنيم. در اين روش cc5/0 از پلاسماي خرگوش يا انسان كه به نسبت 1به 4 رقيق شده در لوله مي‌ريزيم و به اين مجموعه cc1/0 از سوسپانسيون غليظ كشت 24 ساعته باكتري اضافه مي‌كنيم. اين لوله آزمايش را بمدت h6 در بن ماري ^o37 نگه مي‌داريم. در طول اين مدت لوله را كنترل مي‌كنيم و اگر حالت انعقاد يا لخته فيبريني در لوله مشاهده شد نشان دهنده‌ي وجود آنزيم كواگولاز است.

نكته: در بعضي منابع روش سومي هم در نظر مي‌گيرند كه مي‌توان پلاسماي خرگوش يا انسان را به نسبت 12 يا 15% يا محيط نوترين آگار مخلوط كرده و بعد از بسته شدن باكتري را روي آن كشت داده بعد بمدت h24 در ^o37 گرماگذاري كرده و اگر در اطراف كلني باكتري هاله كه در مشاهده شد دليل بر وجود آنزيم كواگولاز است كه اين در حالتي است كه آنزيم خاصيت پروتئوليتيك و يا فيبرينوليتيك داشته باشد.

 

تست Dnase: برخي Sها اين آنزيم را دارند.

براي اين كار باكتري را روي محيط DNA كش داده و بعد از h24 گرماگذاري مقداري از اسيد كلريدريك نرمال روي كلني‌ها اضافه كرده و اگر در اطراف كلني‌ها هاله شفاف ديده شد نشانه‌ي جواب مثبت است.

 

تست مانيتول سالت آگار و يا محيط چاپمن كه حاوي قند مانيتول و نمك %5/7 است.

 

تست احياي نيترات كه در محيط (Indol Nitrite Meclium) INM

 

تست كاتالاز

كاتالاز باعث سم زدايي مي‌شود و H₂O₂ را تجزيه مي‌كند. بنابراين باكتري هوازي بايد كاتالاز داشته باشد.

H₂O₂→O₂+H₂o

93% استرپتوكوك‌ها كاتالاز منفي‌اند.

اگر كاتالاز مثبت باشد جوشش حباب را مي‌بينيم چون واكنش مي‌دهد.

 

تست اكسيداز

اگر تغيير رنگ به آبي يا بنفش ديده شد اكسيداز مثبت و اگر ديده نشد منفي است.

اين محلول هم بايد تازه باشد و هم در مجاورت نور نباشد.

 

سؤال: تركيب معرف؟

MSA قرمز رنگ است چون معرف آن فنل رد است.

اگر باكتري روي MSA هم به زرد تبديل شد باكتري اورئوس است چون فقط آن مي‌تواند نمك را تحمل كند و مانيتول را مصرف كند.

Salt →MSA5/7 تا 10%

چاپمن نيز مثل MSA است.

در vogel jhonson علاوه بر تركيبات MSA، تلوريت پتاسيم است كه اثر سمي دارد و رشد را متوقف مي‌كند اما باكتري مثل استاف اورئوس توانايي تحمل آن را دارد و در حضور آن حتي در محيط و وگل جانسون رشد مي‌كند و كلني‌هاي سياه ايجاد مي‌كند. علت اين امر احياي تلوريت به تلوريم توسط باكتري است.

 

تست نمك

اين محيط يك محيط با پايه‌ي natriant brus با درصد معين نمك است. كه براي آزمايش كافي است مقداري از باكتري مورد آزمايش را داخل اين محيط با درصدهاي مختلف تلقيح مي‌كنيم. سپس گرماگذاري مي‌كنيم. سپس ايجاد كدورت حاصل از رشد در هر كدام از محيط‌هاي نمكي نشانه‌ي مقاوم بودن باكتري به درصد نمك محيط است و اگر كدورت حاصل از رشد در هر كدام از محيط‌ها ديده شد نشان دهنده‌ي اثر ممانعتي نمك بر رشد باكتري خواهد بود. يعني باكتري مورد آزمايش قدرت اين درصد از نمك را ندارد. در استاف‌ها اورئوس بيش‌ترين مقاومت را دارد به همين لحاظ رشد آن در محصولات غذايي نمك‌دار مهم است.

 

INM احياي نيترات: در تست احياي نيترات مي‌توانيم از محيط نيمه جامد INM استفاده مي‌شود. (Indol Nitrite Meelium)

در اين حالت باكتري توانايي احياي نيترات به نيتريت را →ايجاد كمپلكس قرمز آجري پررنگ→ داشته.

مكانيسم ← باكتري با آنزيم‌هاي ردوكتاز نيترات را به نيتريت احيا مي‌كند سپس نيتريت با دو معرف بالا كمپلكس مي‌دهد كه به آن دي آزونيوم گفته مي‌شود كه باعث تغيير رنگ → محيط به قرمز آجري مي‌شود.

 

آزمايش

ميكروكوكوس رزئوس

MSA← حالت جامد ← شيب‌دار← كشت در محل شيب‌دار ← قرمز

INM← ژله‌اي ← زرد

نمك 15% ← مايع ← زرد

بنفش:

Of← جامد← هوازي

Of←جامد← بي‌هوازي

 

ميكروكوكوس لوتئوس

باكتري هوازي ← آخرين پذيرنده‌ي الكترون O₂

 

كلوني رزئوس روي نوترين آگار صورتي مي‌باشد.

كلوني لوتئوس روي نوترين آگار زرد مي‌باشد.

كلوني اورئوس روي نوترين آگار زرد طلايي مي‌باشد.

كلوني اپيدرميديس روي نوترين آگار سفيد مي‌باشد.

كلوني ساپروفيتيكوس روي نوترين آگار زرد ليمويي مي‌باشد.

 

	St.awr	St.epi	St.Sap	Mic.Lut	Mic.Res
MSA	+	-	-	-	-
15%	+	+ (ضعيف)	-	-	-
INM	+	+	-	-	+
OF هوازي	+	+	+	-	+
OF بي‌هوازي	+	+	-	-	-
چاپمن	+	-	-	-	-
وگل جانسون	+	-	-	-	-

 

MSA قند مانيتول دارد.

اگر باكتري مصرف كند ← اسيدي ← زرد

اگر باكتري مصرف نكند← خنثي← قرمز

 

OF: باكتري بايد گلوكز محيط را مصرف كند. معرف بروموكروزول پورپل (بنفش رنگ)

مصرف كند ← اسيدي ← بنفش، زرد مي‌شود+

مصرف نكند ← خنثي← بنفش مي‌ماند –

نمك:

5/6% + ← باكتري بتواند تحمل كند نمك را و رشد كند و كدر شود.

5/1% - ← باكتري نتواند تحمل كند نمك را و رشد نكند و شفاف مي‌ماند.

10%

15%

 

INM: احياي نيترات را نشان مي‌دهد و معرف ندارد و بايد 4-5 قطره اسيد سولفاينيك و چند قطره آلفا نفتيل آمين (5 قطره) مي‌ريزيم. اگر رسوب قرمز بدهد + است.

چاپمن و وگل جانسون: معرف فنل رد- قند مانيتول

وگل جانسون زرد مي‌شود ولي كلني سياه رنگ دارد (Aur).

رنگ هر دو محيط در ابتدا قرمز است و در صورت معرف قند مانيتول توسط باكتري زرد مي‌شود.

 

استرپتوكوك‌ها كوكسي‌هاي qr⁺ هستند. شبيه زنجير بدنبال هم- كاتالاز منفي هستند (تفاوت با استافيلوكوك‌ها)

طبقه‌بندي معمولاً براساس توليد هموليزين روي محيط بلاد آگار قابل انجام است و مي‌توانيم آنها را به استرپتوكوك‌هاي α هموليتيك، β هموليتيك، γ هموليتيك تقسيم كرد. استرپتوكوك‌هاي پايوژن (گروهA) β هموليتيك‌اند و از همه مهم‌تراند كه براساس خاصيت آنتي ژني به گروه‌هاي سرولوژي كوچكتري تقسيم مي‌شود. يكي از اساس‌هاي گروه بندي براي اين باكتري‌ها تقسيم بندي آنها به روش lanc field هست كه براساس اين دسته بندي استرپتوكوك‌هاي β هموليتيك را به گروه‌هاي H, G, C, B, A و... كلاً از A تا T بجز I تقسيم مي‌كنند. مهمترين آنها يكي گروه A و ديگري گروهD هست و A, D, B, C, G, H از نظر بيماري زايي مهم‌اند و اين تقسيم بندي براساس نوع كربوهيدرات ديواره است. حركت در استرپتوكوك‌ها منفي است. آنزيم كاتالاز ندارند به جز %7 آنها و بعضي از آنها براي رشد احتياج به 2 تا 10% كربن دي اكسايد هستند كه اصطلاحاً به آنها كاپنوفيليك (capnophilic)، بعضي از انواع آنها نسبت به حرارت مقاوم‌اند ولي اكثر آنها حرارت ^o60 را بمدت زياد نمي‌توانند تحمل كنند. تحمل آنها در حضور نمك طعام متفاوت است و مقاوم‌ترين‌شان استرپتوهاي گروهD اند كه تا 6% نمك را تحمل مي‌كنند. بعضي از آنها توانايي هيدروليز ماده‌اي بنام Esculin را دارند كه در اين حالت اسكولين تبديل به ماده‌اي بنام اسكوليتين (Esculitin) و از طرفي چون در محيط اسكولين مقداري آهن هم وجود دارد لذا اسكوليتين با آهن تركيب شده و ايجاد كمپلكسي بنام Phenolic Iron Complex مي‌كند كه بسيار مهم است و باعث تغيير رنگ محيط به قهوه‌اي مايل به سياه مي‌شود. در تركيب محيط اسكولين مي‌توان صفراي حيواني بنام Bile را اضافه كنيم و محيط بايل اسكولين در لوله آزمايش بسازيم و باكتريايي كه به بايل يا صفرا مقاوم هستند و هيدروليز كننده اسكولين باشند بطور همزمان در اين آزمايش مي‌شود و پس از كشت دادن در اين محيط كشت و گرماگذاري مناسب و مي‌توانيم ايجاد رنگ قهوه‌اي مايل به سياه را پس از h24 دليل +‌بودن آزمايش بدانيم. در اين محيط علاوه بر اسكوليتين مقداري گلوكز نيز توليد مي‌شود.

استرپتوكوك‌هاي پايوژن براي ما مهم هستند و تشخيص آزمايشگاهي آنها بايد بخوبي مشخص شود. در ابتدا بايد نمونه‌گيري به طرز صحيح صورت گيرد با استفاده از سوآپ‌هاي استريل از گلو و بيني يا در مواردي كه گلودرد وجود دارد مي‌توان از گلوي افراد نمونه بگيريم يا با اين وسيله از واژن در موارد تب‌هاي زايماني يا از چرك كه در عفونت‌‌هاي چركي و موقعي كه عفونت خون وجود دارد مي‌توان استفاده كرد. نمونه‌ها بايد بلافاصله به آزمايشگاه برده شود. و اگر بيش از 6 تا 8 ساعت احتمال تأخير داده مي‌شود بايد سوآپ‌ها را در محيط‌هاي كشت انتقالي وارد كرده و به آزمايشگاه برده شود. از اقدامات مهم اوليه انجام رنگ آميزي گرم از نمونه مستقيم و بعد كشت دادن سوآپ‌هاي آغشته به نمونه بر روي بلاد آگار و گرماگذاري پليت‌ها بمدت h24 در دماي ^o37 تا بدين وسيله نوع هموليز را در اطراف كلني استرپتوكوك‌ مشاهده كنيم. مرحله بعد استفاده در تست‌هاي حساسيت آنتي بيوتيكي كه در رابطه با استرپتوكوك‌هاي گروهA يا پايوژن مي‌توان از ديسك باسيدراسين استفاده نمود و در واقع حساسيت ويژه‌ي Sهاي پايوژن به اين ديسك آنتي بيوتيكي از اهميت بسياري برخوردار است. روش‌هاي سروتيپ كردن به روش lanc field هم مي‌تواند انجام بگيرد كه بيشتر براي مطالعات اپيدميولوژيك و بررسي منبع و راه انتشار عفونت است. از تست‌هاي ديگر عبارت است از تست سرولوژيك كه براي شناسايي و اثبات عفونت با Sهاي پايوژن صورت مي‌گيرد مثل هنگام گلودرد و يا معمولاً در اغلب موارد تب روماتيسمي و يا عفونت‌هاي كليوي حاد. چون در اين نوع عفونت‌ها امكان جواب ندادن كشت ميكروبي وجود دارد لذا انجام آزمايشات سرولوژيك بسيار مهم است. در اين آزمايش‌ها بدنبال آنتي بادي خاصي كه معمولاً آنتي استرپتولايزينo مي‌باشد (ASO) مي‌گرديم. كه تيتر آن در اين موارد به بيش از 200 واحد todel در هر ml مي‌رسد. كه در اغلب اين عفونت‌ها بيش از 80% تيتر بالاي ASO ديده مي‌شود. از آزمايش‌هاي ديگر مي‌توان به آنتي Dnase، آنتي هيالورونيداز و... در تشخيص نهايي استفاده كنيم.

 

استرپتوكوكوس‌ها

پايوژن (گروهA)

Agalgtia (B)

(Entrococcus faecalis) Faecalis←D (مدفوعي)

پنموكوكوس (استرپتوكوكوس نمونيا)

Viridans (دهاني)

رنگ آميزي گرم

تست كاتالاز (93%) (-)

هموليز

β← مثل گروهA

β← مثل گروهB

α← مثل گروه D

α← مثل پنموكوك‌ها عامل تيپيك ذات الريه

α←مثل ويريدانس

براي گروهA ديسك بايت راسين مي‌گذاريم. به باسيدراسين حساس‌اند و فقط اين گروه حساس‌اند. براي گروهB تست CAMP را انجام مي‌دهيم يا تستي بنام تجزيه هيپورات سديم (sodium hyporat)

براي مدفوعي رشد در PH قليايي (6/9) يا رشد در N.B (نوترين براس) 5/6% نمك دارد يا محيط Bilesculin هم مقاوم به املاح صفراوي و حتي براي اينها محيط كشتي بنام محيط SF (محيطي انتخابي و رشد در نمك و تحمل PH قليايي كه اين محيط داراي تركيبي بنام آزيدسديم است كه باعث توقف رشد ساير كوكوس‌ها و افزايش رشد گروهD.

 

تست‌هاي شناسايي براي جداسازي پنموكوك‌ها از Sهاي گروه ويريدانس

با توجه به اينكه Sهاي ويريدانس و پنموكوك‌ها از لحاظ شكل و آرايش ميكروسكوپي و همچنين واكنش‌ها هموليتيك (α هموليز) به همديگر شبيه هستند لذا با انجام تست‌هاي زير بخوبي مي‌توانيم پنموكوك‌ها يا ديپلوكوكوس‌ها را تشخيص دهيم كه اين تست‌ها عبارتند از حساسيت به ديسك اپتوچين و ديگري حل شدن در املاح صفراوي است.

و ديگري هم تست تورم كپسول يا تست (quelling)

اپتوچين تركيبي است بنام اتيل هيدروكوپرئين هيدروكلرايد كه در بين Sها باكتري‌هاي پنموكوك به اين ماده حساس هستند و براي اين منظور مقداري از كلني‌هاي α هموليز مشكوك را برداشت كرده در سطح يك محيط بلاد آگار كشت انبوه و متراكم و يكنواخت تهيه كرده سپس با يك پنس استريل يك ديسك آغشته به ماده‌ي اپتوچين را بر روي محيط قرار مي‌دهيم و پليت را بمدت h24 در دماي 35 تا ^o37 گرماگذاري مي‌كنيم و در صورتي كه هاله‌اي به قطر 15 تا 18 mm در اطراف ديسك اپتوچين مشاهده شد نشان دهنده‌ي اين است كه باكتري مورد آزمايش پنموكوك مي‌باشد و اگر قطر هاله كمتر از اين مقدار بود نشانه‌ي اين است كه باكتري پنموكوك نيست و لذا پنموكوك‌ها تنها گروهي هستند كه حساس به اپتوچين هستند. نكته اينكه غلظت يا تراكم ماده‌ي اپتوچين حداكثر بايد يك روي 500000 باشد و نه بيشتر. – تست ديگر تست كوالانگ مي‌باشد. پنموكوك‌ها با توجه به اينكه با آرايش دوتايي و يا شعله شمعي و با يك كپسول متراكم و مشخص در زير ميكروسكوپ ديده مي‌شوند. لذا از كپسول آنها در تشخيص و شناسايي و حتي تيپ بندي اين باكتري‌ها به بيش از 80 تيپ كه حتي تا 100 هم گزارش شده استفاده مي‌شود. علت اين موضوع تفاوت و گوناگوني در نوع تركيب پلي ساكاريدي كپسول در تيپ‌هاي مختلف پنموكوك‌هاست. اما اين پلي ساكاريد تنوع آنتي ژنيك دارد. براي آزمايش از كلني مجهول برداشت كرده و يك سوسپانسيون نسبتاً غليظ تهيه كرده. 1 قطره از اين سوسپانسيون در مركز لام تميز قرار داده سپس 1قطره از آنتي سرم ضد كپسول (آنتي سراي پلي والان) روي سوسپانسيون اضافه مي‌كنيم و البته 1 قطره رنگ بلودومتيلن هم به اين مجموعه اضافه مي‌نماييم. نهايتاً با عدسي 100 در زير ميكروسكوپ ميدان ديد را مشاهده و نمايان شدن يك حلقه‌ي با قطر مشخص و متورم در اطراف ديپلوكوك نمونيا نشانه‌ي واكنش كوالانگ يا همان تورم كپسول است و از آنجايي كه آنتي سرم مربوطه فقط بر عليه كپسول پنموكوك‌ها تهيه شده لذا Sهاي ويريدانس با اين آنتي سراها واكنش نمي‌دهند. بطور كلي اساس واكنش كوالانگ واكنش بين آنتي ژن كپسولي با آنتي سرم ضد آن است در واقع يك آزمايش ايمونولوژيكي است.

تست حل شدن در املاح صفراوي: براي اين آزمايش از نمك‌هاي صفراوي كه معمولاً از نوع اسيدهاي صفراوي هستند استفاده مي‌شود. كه معمولاً نمك‌هاي صفراوي عبارتند از تركيباتي مثل توروكولات سديم و يا تركيب ديگري بنام دزوكسي كولات سديم كه در ساختمان شيميايي اين نمك‌ها يك حلقه‌ي مركزي شبيه به كلسترول وجود دارد كه نام آن عبارت است از سيكلوپنتانو پرهيدروفنانترن كه قدرت پايين آوردن كشش سطحي را در باكتري دارد. در واقع هنگامي كه h48 تا 72 از كشت باكتري بگذرد آنزيم‌هايي بنام اتوليزين در پنموكوك‌ها فعال و ترشح مي‌شوند كه باعث مرگ و اتوليز خود باكتري مي‌شود كه نشانه‌ي آن مقعر شدن سطح كلني اين باكتري در كشت‌هاي كهنه. اين نمك‌ها به حلاليت خودبخودي اين باكتري‌ها در محيط داراي نمك‌هاي صفراوي كمك مي‌كنند.

براي آزمايش به يك لوله‌ي آزمايش مقداري از نمك‌هاي صفراوي و معرف فنل رد اضافه مي‌كنيم و يك لوپ يا مقداري از كشت 72 ساعته باكتري را برداشته و در آن تلقيح مي‌كنيم. همچنين يك لوله ديگر برداشته و بعنوان لوله شاهد در آن مقداري NaCl اضافه كرده و از باكتري موردنظر در آن كشت مي‌دهيم. هر دو لوله آزمايش را در شرايط Co₂ و در دماي ^o37 بمدت h24 گرماگذاري مي‌كنيم كه اگر بعد از 24 تا 48 ساعت لوله‌ي حاوي نمك‌هاي صفراوي شفاف و لوله‌ي حاوي NaCl كدر باشد نشان دهنده‌ي وجود پنموكوك است. در حالي كه اگر در هرد و لوله آزمايش كدورت حاصل از رشد مشاهده شد نشان دهنده‌ي اين است كه باكتري مورد آزمايش متعلق به گروه‌ Sهاي ويريدانس هست.

 

نتايج آزمايش‌ها: استرپ گروهD

6/1= PH← رشد كرده (كدر و زرد رنگ)

هر لوله‌اي در هر PHايي وقتي بعد از تلقيح كدروت را ديديم، باكتري تحمل كرده و رشد كرده، انتروكوك‌ها PH قليايي را بخوبي تحمل مي‌كنند.

نمك 5/6% ←رشد كرده (كدر زردرنگ) ← سپس باكتري تحمل نمك را دارد.

اگر استرپ‌هاي گروه A را در اين محيط تلقيح دهيم رشد نمي‌كند.

بايل اسكولين← تغيير رنگ محيط از قهوه‌اي كمرنگ به قهوه‌اي سياه← بايل اسكولين +

بلاد آگار← استرپ D به هر دو ديسك مقاوم است و رشد مي‌كند ولي استرپ A به ديسك باسيه راسنين حساس اما به اپتوچين مقاوم است.

 

Pre lab

تشخيص آزمايشگاهي نايسريا

1. تشخيص ميكروسكوپي: براي تشخيص عفونت كونوكوكي (عفونت ناشي از نايسريا كونورئا) يا سوزاك در مردان مبتلا به عفونت انجام رنگ آميزي گرم بسيار مهم است و ارزش تشخيصي بالاي 90% دارد. بخصوص در افرادي كه داراي عفونت چركي مجراي ادرار هستند. با رنگ آميزي ترشحات چركي مي‌توانيم ديپلوكوك‌هاي گرم منفي و حتي كپسول‌دار را در داخل پلي مورفونوكلوئرها ببينيم.

سپس رنگ آميزي گرم را مي‌توانيم بطور مطمئن براي تشخيص عفونت مجراي ادراري در مردان بكار ببريم اما در مورد زنان و يا مردان بدون علامت اين روش خيلي مطمئن نيست و در اين حالت بايد با روش‌هاي كشت به جواب قطعي برسيم. نايسريا مننژايتيديس را براحتي مي‌توان در مايع مغزي نخاعي (CSF) افراد مبتلا به مننژيت ببينيم و اگر بيمار قبلاً آنتي بيوتيك دريافت كرده باشد ديگر قابل مشاهده نخواهد بود و كلاً تعداد باكتري‌ها در خون بيماران مبتلا به باكتريمي مقداري كم است و لذا رنگ آميزي گرم براي اين افراد خيلي ارزش ندارد اما در مقابل با توجه به اينكه تعداد مننگوكوك‌ها در افراد بيماري كه بيماري حاد مننگوكوكي (مننژيت) داشته باشند زياد هست لذا رنگ آميزي گرم لكوسيت‌هاي خون محيطي مي‌تواند باعث مشاهده مننگوكوك‌ها شود.

 

2. در اين روش بايد بطور صحيح نمونه‌گيري انجام شود. مثلاً نايسريا كونورئا را براحتي مي‌توان از ترشحات تناسلي جدا كرد و با توجه به اينكه در ناحيه‌ي تناسلي و ركتال امكان وجود باكتري‌هاي مزاحم ديگر هم هست بايد از نمونه‌ها بر روي محيط‌هاي كشت انتخابي و اختصاصي كشت دهيم مانند محيط تايرمارتين كه اين محيط كشت يك محيط كاملاً انتخابي براي نايسرياهاست و داراي چندين آنتي بيوتيك كه از رشد نايسرياهاي غير بيماري‌زا جلوگيري مي‌كند. اين محيط كشت يك محيط انتخابي و اختصاصي براي نايسريا گونورئا محسوب مي‌شود. حاوي ونكومايسين(جلوگيري از رشد گرم +ها)، كليستين، نيستاتين (ضد قارچ)، Sxt (جلوگيري از رشد پروتئوس‌ها: باسيل‌هاي گرم منفي از خانواده انتروباكترياسر).

محيط‌هاي اختصاصي و انتخابي ديگر عبارتند از MTM تركيبي مشابه با T.M (تايرمارتين) دارد و محيط ديگر Myc كه شفاف است. داراي نشاسته و عصاره‌ي مخمر است و همچنين داراي هموگلوبين و پلاسماي اسب به اضافه‌ي آنتي بيوتيك‌هاي محيط‌هاي قبلي. محيطي مانند شكلات آگار يك محيط غيرانتخابي براي نايسرياها است. كه بايد پليت‌ها در %10-5 Co₂ و در دماي ^o37 قرار داده شود. تست‌هاي ديگري كه براي تشخيص مطرح هستند يكي تست‌هاي بيوشيميايي مصرف قندها (گلوكز و مالتوز)، تست اكسيداز و كاتالاز و نهايتاً تست‌هاي مولكولي كه با دقت بالا مي‌تواند در تشخيص اسيدنوكلئيك نايسرياها بكار برده شود. استفاده از كيت‌هاي تشخيصي سريع مثل كيت‌هاي APA باسيل‌هاي گرم + بدون اسپور Gram Positive non-enclospore forming Bacilli

سه جنس مهم دارند:

- Listeria←monocytogenes

- corynebacterium←diphteriae

- eryseplothrix

بطور كلي باكتري‌هاي موجود در اين گروه نزد انسان و حيوان مي‌توانند بيماري ايجاد كنند و اندازه‌ي آنها متفاوت است. مثلاً از فرم كوكوئيد تا فرم باسيل‌هاي بلندتر و كشيده‌تر قابل مشاهده است. از لحاظ باليني جنس ليستريا و جنس كورينه باكتريوم از اهميت خاصي برخوردار است.

 

جنس ليستريا: باكتري‌هاي ليستريا تصور مي‌شده كه در حيوانات پست مشاهده شده و از آنها جدا شده و مشاهده شده كه از حيوانات مي‌تواند به انسان انتقال پيدا كند و در انسان ايجاد سپتيسمي، مننژيت و عفونت دستگاه تناسلي بويژه در زنان مي‌نمايد. اين باكتري‌ها مي‌تواند از جمله عوامل بيماري مونونوكلئوز عفوني باشند. ليسترياها در زير ميكروسكوپ بصورت باسيل‌هاي گرم+ كوچك ديده مي‌شوند و در كشت كهنه ممكن است بصورت باسيل‌هاي بلند هم ديده شود. اين باكتري‌ها پرنياز بوده و براي رشد به محيط‌هاي كشت غني شده احتياج دارند و روي محيط‌هاي كشت معمولي رشد نمي‌كنند. ضمناً كشت آنها بايد در شرايط حضور 3تا 10% Co₂ قرار بگيرد (گرماگذاري شود).

اين باكتري‌ها هموليز β ايجاد مي‌كنند و كلني‌هاي آنها بر روي محيط‌هاي جامد بصورت ريز و گرد ديده مي‌شود. كه در كشت كهنه اطراف كلني‌ها بصورت برآمده ديده مي‌شوند. ديگر اينكه اين باكتري‌ها در PH قليايي بهتر از PH اسيدي رشد مي‌كنند و نسبت به نمك مقاوم هستند. تست كاتالاز در اين باكتري‌ها + است. باكتري‌هاي جنس ليستريا سرما دوست‌هاي اختياري محسوب مي‌شوند و لذا براي جداسازي آنها مي‌توان كشت اين باكتري‌ها را در يك محيط انتخابي بنام ليستريا سلكتميوآگار انجام داد و درد ماي پايين (دماي يخچال ^o7-4) بمدت چند روز قرار دهيم و در اين شرايط باكتري‌هاي ليستريا نسبت به ساير باكتري‌ها كه در سرما قادر به رشد نيستند بخوبي اما كندتر رشد مي‌كنند. به اين نوع فرآيند جداسازي، فرآيند غني سازي در سرما يا enrichmentcold گفته مي‌شود.

باكتري ليستريا مونوسايتوژنز در دماي ^o25 داراي تاژه‌هاي پيراموني است در حالي كه در ^o37 تك تاژه قطبي دارد. براي مشاهده‌هاي تست حركت در اين باكتري مقداري از كلني آن را در شرايط استريل درون يك محيط نيمه جامد مخصوص حركت بنام motility medium تلقيح مي‌كنيم. (با فيلد و پلاتين سوزني). سپس محيط‌ها را در دمايc ^o25 بمدت h24 گرماگذاري مي‌كنيم كه در اين صورت يك حركت چتري شكل در لوله آزمايش مشاهده مي‌شود كه چنين حركتي در ^o37 ديده نمي‌شود. در مورد اين باكتري انجام تست مصرف قندها بويژه قند گلوكز و لاكتوز مهم است. كه در مورد اين دو قند واكنش در اين باكتري+ است. در حالي كه در اين باكتري مصرف قند ديگري مانند مانيتول منفي است. تست احياي نيترات در آن منفي در حالي كه واكنش هيدروليزاسكولين و بايل اسكولين در آن + است.

 

كورينه باكتريوم: بطور كلي به دو دسته‌ي بيماري‌زا و غير بيماري‌زا تقسيم مي‌شوند كه انواع كورينه باكتريوم‌هاي غير از كورينه باكتريوم ديفتريا (عامل ديفتري) را اصطلاحاً ديفتروئيد ناميده مي‌شوند. كه اين ديفتروئيدها فاقد اگزوتوكسين هستند و انواع بيماري‌زا بعلت داشتن اگزوتوكسين قوي در عفونت‌هاي خون و توليد بيماري ديفتري دخالت دارند. اندازه‌ي اين باكتري‌ها بطور كلي كوچك است و به آنها كوكوئيد هم مي‌گويند و آرايش آنها هم بسته به نوع آنها فرق مي‌كند. مثلاً عامل ديفتري آرايشي شبيه به حروف چيني دارد در حالي كه ديفتروئيدها امكان دارد آرايش نردباني داشته باشند. بطور كلي كورينه باكتريوم‌ها امكان دارد در اغلب آنها دانه‌هاي ذخيره‌اي و مغذي بنام دانه‌هاي متاكروماتيك يا ولوتين در داخل سيتوپلاسم وجود داشته باشند كه در تشخيص اين باكتري‌ها بسيار ارزشمندند. جنس اين دانه‌ها از RNA، پلي فسفات‌هاي آلي و Pr است و در انواع مختلف كورينه‌ها تعداد آنها هم متفاوت ديده مي‌شود. اين دانه‌هاي ذخيره‌اي با يك رنگ آميزي اختصاصي بنام آلبرت در داخل سيتوپلاسم به رنگ قهوه‌اي مايل به بنفش در يك قطب يا در دو قطب سلول و يا حتي بصورت دانه‌هاي تسبيح بدنبال هم در زير ميكروسكوپ قابل رويتي هستند. ديفتروئيدها معمولاً بطور طبيعي در گلو، در پوست و يا ناحيه‌ي واژن زندگي مي‌كنند و هنگامي كه شخصي مبتلا به بيماري ديفتري مي‌شود ممكن است وجود ديفتروئيدها در گلو مانع از تشخيص دقيق شود و در اينجاست كه بايد علائم باليني مانند تب شديد، تنفس سخت و گلودرد شديد را در بيمار مورد توجه قرار داد و در برداشت مستقيم از نمونه و رنگ آميزي آلبرت از آن با مشاهده‌ي دانه‌هاي متاكروماتيك در باسيل‌هاي گرم+ كورينه جواب آزمايش را+ تلقي مي‌كنيم و ديگر نبايد منتظر جواب كشت ميكروبي باشيم و شخص مراجعه كننده را بايد فوراً به پزشك مراجعه داده تا در اولين فرصت تحت سرم درماني قرار بگيرد و از مرگ نجات پيدا كند. اما براي انجام آزمايش‌هاي باكتريولوژيك و تكميل آنها و بدنبال ديدن باسيل‌هاي گرم+ كوچك مي‌توانيم از نمونه مورد آزمايش در سطح محيط‌هاي مانند بلاد آگار داراي تلوريت پتاسيم و يا محيط سوفلر كه محيط‌هاي اختصاصي براي كورينه باكتريوم‌ها و انواع بيماري‌زا محسوب مي‌شوند كشت داده و كلني‌هاي اين باكتري‌ها را در سطح اين محيط‌ها بررسي كنيم. و نكته‌ي مهم اين است كه انواع بيماري‌زاي كورينه‌ها 3 نوع هستند كه عبارتند از: كورينه باكتريوم گراويس C. intermeelius, (gravis) و C. Mitis كه شكل و اندازه‌ي كلني و شدت بيماري‌زايي در اين سه نوع با هم متفاوت است مثلاً gravis از همه بيماري‌زاتر است و بعد از آن اينترمريوس و ميتيس قرار مي‌گيرند.

از لحاظ شكل كلني همه‌ي اين 3 نوع در سطح محيط بلاد آگار داراي تلوريت پتاسيم كلني‌هاي گردي توليد مي‌كنند كه به رنگ سياه ظاهر مي‌شود. اما از لحاظ مرفولوژي كلني و اندازه در آنها تفاوت‌هايي است. مثلاً اندازه‌ي كلني گراويس 3تا5 mm و كناره‌ي كلني به حالت دندانه‌دار و كلني نهايتاً شبيه به گل مينا است. يا در نوع اينترمريوس اندازه كلني كوچك است، حداكثر تا mm2، كلني‌ها برجسته، سياه رنگ و شفاف، شبيه به تخم قورباغه است و در نوع ميتيس اندازه كلني بين mm2تا4، كناره كلني نسبتاً صاف، با سطح كمي محدب به رنگ خاكستري پررنگ كه شبيه به تخم مرغ نيمرو است. هر سه نوع اين كورينه‌ها در سطح محيط سوفلر توليد كلني‌هاي زرد مايل به خاكستري مي‌كنند. براي شناسايي آنها مي‌توان از تخمير انواع قندها بعنوان تست‌هاي بيوشيميايي استفاده كرد. بخصوص مثل گلوكز، لاكتوز، ساكارز و مانيتول.

تست هيدروليز اسكولين و بايل اسكولين هم در آنها مي‌شود بررسي كرد. همچنين تست احيا نيترات، كاتالاز، حركت (كه در آنها منفي است) و مشاهده‌ي هموليز. مثلاً ديفتروئيدها همگي α هموليزند.

در رابطه با كورينه باكتريوم ديفتريا تستي بنام تست Elek مطرح است (در گزارش كار تحقيق شود).

 

آزمايش و نتايج

محيط قند لاكتوز ← رنگ قرمز ←مايع

محيط INM← جامد ← زردرنگ

محيط MM (موتيليتي مديوم) ← نيمه جامد← شيري رنگ

محيط بايل اسكولين ← جامد

محيط ليستريا سلكتيو آگار ← محيط زرد رنگ (كشت 4 منطقه)

كورينه باكتريوم:

- محيط سوفلر ← انتخابي← سفيد (محيط اختصاصي)

- تلوريت پتاسيم (TK) ← قهوه‌اي رنگ (زرد مايل به نارنجي)

 

ميكروسكوپ:

ليستريا← باسيل g⁺

كورينه باكتريوم ديفتريا ← باسيل g⁺

كورينه باكتريوم ← رنگ آميزي آلبرت ← مشاهده متاكروماتيك در دو قطب سلول باكتري

 

	ليستريا	كورينه
لاكتوز	+ زرد	-
MM	حركت چتري	-
BS	قهوه‌اي سياه+	بدون تغيير رنگ-
INM	-	+
تلوريت پتاسيمTK		رشد
سوفلر		رشد

 

تست لاكتوز

در حالت عادي رنگ قرمز است چون PH خنثي است. Phenol Red Broth Base

محيط پايه فنل رد كه در اين محيط مي‌شود انواع قندها را افزود.

ولي وقتي بعد باكتري را بهش تلقيح كنيم و گرماگذاري كنيم h24 و ^o37-35 مي‌بينيم رنگ محيط زرد شد كه نشان دهنده‌ي توليد اسيد و تخمير آن قند است.

 

MM

تك تاژه← ^o37 – 25 (ليستريا) گرماگذاري h24 ← حركت چتري (تاژه‌هاي پيراموني)

 

تست INM

كمپلكس قرمزرنگ → روي محيط → اسيد سولفانيليك →α نفتيل آمين: معرف

قرمز آجري

↓

احيا نيترات+

 

Bacillaceaخانواده

Bacillus جنس

G⁺ Bacilli/ Aerobic/ endospore forming/ motile /Catalase⁺/ oxidase/

Amylase/ protease/ gelatinase/ lucetinase/ phospholipase/ soil/ plant/animal

Pathogen →B. anthrasis

Non pathogen → B. subtilis

Food poisoning → B. cereus

 

از لحاظ كلني ← كلني باسيل سرئوس در سطح نوترين آگار كلني‌هاي: تخت، پهن و سفيد و مات با كناره‌هاي نامعين هموليز β مي‌دهد.

كلني sub روي نوترين آگار تخت و با مركز مات و تيره‌تر و كناره‌ي دندانه‌اي روي بلاد آگار بدون هموليز است.

B. ant كلاً غيرمتحرك است. كلوني بصورت دوك در آمده است يا موي مجعد محيط آميلاز (starch agar) شيري رنگ، زرد كمرنگ.

 

تجزيه‌ي ژلاتين

بررسي واكنش (lucetnase) Egg yolk reaction

 

آزمايش

محيط SIM← زرد رنگ مايل به قهوه‌اي نيمه جامد (باكتري مورد آزمايش ما B.ant)

محيط S← مايع قرمز

محيط M← مايع قرمز

محيط G← زرد رنگ حالت ژلاتيني

 

	B.ant	B.cer	B.sub
مانيتول	-	-	+
سالي سين	-	+	+
SIM	-	+	+
ژلاتين	+	+	+
S.A استارچ آگار	+	+	+

 

در رابطه با مانيتول محيط فنل رد براس بيس استفاده مي‌شود. داراي چند درصد قند نيز هست. رنگ اوليه محيط بخاطر PH خنثي قرمز است. اگر باكتري قند را مصرف كند توليد اسيد كرده (اسيدهاي آلي) و PH اسيدي شده و لذا رنگ معرف به زرد تبديل مي‌شود.

 

SIM: ← حركت ←h24/ ^o37- 35

ژلاتين يك تركيب درشت مولكول است (پلي پپتيدي) و در ^o20 به پايين سفت و منعقد مي‌شود.

برخي باكتري‌ها آنزيم ژلاتيناز دارند كه ژلاتين را تجزيه مي‌كنند به زير واحدهاي سازنده قابل هضم براي باكتري بخصوص باسيلوس‌ها.

 

S.A← هيدروليز نشاسته در محيط starch agar

كشت نقطه‌اي باكتري ←h48 / ^o37- 35 ← چند قطره محلول لوگل روي سطح پليت

اگر رنگ بنفش يا آبي پررنگ تشكيل شد آميلاز –

اگر رنگ بنفش يا آبي پررنگ تشكيل نشد آميلاز +

اين نتيجه به اين دليل است كه معرف لوگل مي‌تواند با نشاسته كمپلكس رنگي آبي- بنفش بدهد. يعني هر جا نشاسته در محيط كشت دست نخورده وجود داشته باشد اين كمپلكس ديده شد و نشانه‌ي عدم وجود آميلاز است و اگر بعد از اضافه كردن لوگل ببينيم كه در اطراف منطقه‌ي كشت يك هاله‌ي بي‌رنگ توليد شود و رنگ معرف لوگل هم تغيير نكند، نشانه‌ي مصرف شدن نشاسته در محيط توسط آنزيم آميلاز مي‌باشد يعني باكتري آميلاز+ است. توضيح اينكه نشاسته هم يك پلي ساكاريد درشت مولكول است و مستقيماً قابل مصرف براي باكتري نيست و البته تعداد محدودي از باكتري‌ها داراي آنزيم تجزيه كننده نشاسته هستند و با آنزيم آميلاز مي‌توانند اين تركيب را در محيط اطراف خودشان تجزيه و تبديل به زير واحدهاي قابل هضم كند.

پس آنزيم آميلاز يك آنزيم خارج سلولي است.

 

Enterobacteriaceae

خانواده انتروباكترياسه خانواده‌ي بزرگي محسوب مي‌شوند كه برخي از آنها به عنان فلور طبيعي بدن در دستگاه گوارش ساكن هستند و برخي ديگر از آنها مي‌توانند بيماري‌زا و پاتوژن باشند. در اين خانواده بزرگ، جنس‌ها و گونه‌هاي متعددي قرار دارند كه تشخيص افتراقي و صحيح آنها در آزمايشگاه بايد به خوبي انجام گيرد. براي تشخيص افتراقي اعضاي اين خانواده از يك تست تشخيصي افتراقي با فرمولي بنام IMuic كه مجموعه‌اي است از 4 تست كليدي با پايه و اساس واكنش‌هاي بيوشيميايي. به همين دليل به اين تست، تست‌هاي بيوشيميايي افتراقي گويند كه با اين تست‌ها اعضا خانواده انتروباكترياسه بخوبي از هم شناسايي مي‌شوند و نكته مهم اينكه نتيجه اين تست‌ها را حتماً بايستي بعد از گذشت h24 و نه بيشتر بررسي و تفسير كنيم.

در اين تست حرف I مخفف تست indol است. M مخفف MR (متيل رد)، v←vp (واگس پرسكوئر)، I براي تشنگي تلفظ است و c←citrate معرف سيترات است.

براي ايندول يك محيط SIM (نيمه جامد) برداشته. بعد با فيلد و پلاتين استريل مقداري از باكتري را در آن تلقيح مي‌كنيم. بعد در ^oC 37-35 بمدت h24 گرماگذاري كرده. سپس چند قطره معرف كواكس (covacs) روي محيط اضافه مي‌كنيم، كه تغيير رنگ و ايجاد حلقه‌ي قرمز روي سطح محيط نشان دهنده‌ي توليد Indol توسط باكتري مورد آزمايش است و عدم تغيير رنگ و ايجاد حلقه نشانه‌ي عدم توليد ايندول.

 

مكانيزم آن: باكتري با آنزيمي بنام تريپتوفاناز، اسيد آمينه‌ي تريپتوفان محيط SIM را تجزيه و توليد ايندول و تركيبات ديگر مي‌كند. ايندول با معرف كواكس واكنش داده و حلقه‌ي قرمز تشكيل مي‌شود. مثل E.coli

 

تركيبات شيميايي معرف كواكس چيست؟

تست uP و MR : معمولاً با هم انجام مي‌شود. به اين صورت كه مقداري محيط كشت مايع mrup استريل در لوله آزمايش تهيه مي‌كنيم (cc5). بعد باكتري مورد نظر را (الوپ) تلقيح كرده و سپس لوله را در دماي ^oC 37-35 بمدت h24 گرماگذاري كرده. سپس محتويات لوله آزمايش را به دو لوله و به دو قسمت مساوي تقسيم مي‌كنيم. (دو تا cc5/2)

يكي از لوله‌ها را براي تست MR و يك لوله ديگر را براي up مي‌گذاريم. براي آزمايش mr، چند قطره معرف متيل رد روي محيط مي‌ريزيم. اگر محيط قرمز شد نشانه‌ي مصرف قند محيط و توليد اسيد و تغيير رنگ معرف به قرمز است. مثلاً گلوكز به اسيد سيپروويك تبديل شده و سپس به اسيدلاكتيك و... تبديل مي‌شود و اگر رنگ قرمز مشاهده نشد، واكنش mr منفي است.

براي تست up چند قطره معرف α- نفتل و مصرف KOH (40%) روي محيط اضافه مي‌كنيم و بين 20-10 min صبر مي‌كنيم (محيط نبايد تكان بخورد). اگر حلقه‌ي قرمز روي محيط ايجاد شد نشانه‌ي واكنش up⁺ است و اگر بدون تغيير رنگ باقي ماند واكنش up منفي است.

 

مكانيزم: باكتري‌هايي كه قادر باشند در راه يا در مسير متابوليسم گلوكز توليد ماده‌ي حد واسطي بنام استيل متيل كربينول بكنند (يا استوئين)، اين ماده حد واسط مي‌تواند با معرف‌هاي آزمايش توليد يك كمپلكس قرمز آجري رنگ كند كه در اين صورت مي‌گوييم آزمايش up+ است.

معمولاً نتيجه‌ي تست MR با تست up عكس همديگر هست.

 

آزمايش سيترات

در اين آزمايش از يك محيط كشت اختصاصي بنام سيمون سيترات استفاده مي‌شود. (محيط جامد شيب‌دار). براي آزمايش مقداري از باكتري مورد آزمايش را در سطح محيط كشت، كشت مي‌دهيم و لوله را بمدت h24در ^oC 37-35 گرماگذاري مي‌كنيم. در صورتي كه مشاهده شود رنگ محيط از سبز به آبي ايجاد شود نشانه‌ي مصرف سيترات است. (سيترات+) يعني باكتري از اين تركيب بعنوان منبع كربن استفاده كرد. و اگر تغيير رنگ محيط را نديديم و تغيير نكرد، سيترات منفي است.

مكانيزم به اين شكل است كه اين محيط داراي سيترات آمونيوم است و همچنين معرف بروموتيمول بلو و اگر باكتري آنزيم سيترات سياز داشته باشد، سيترات را تجزيه مي‌كند و يون‌هاي آمونيوم در محيط آزاد مي‌شوند و اين يون PH محيط را قليايي مي‌كنند و در PH قليايي، رنگ بروموتيمول از سبز به آبي تغيير مي‌كند. و اگر رنگ محيط به همان رنگ سبز باقي ماند نشانه‌ي مصرف نشدن سيترات است و باكتري آنزيم سيترات سياز را نداشته و سيترات منفي است.

 

تست ديگري براي تشخيص تست TSI مي‌باشد. (triple sugar iron agar)

اين محيط يك محيط جامد و شيب‌دار است. اين محيط سه قند دارد در تركيبش؛ گلوكز، لاكتوز و ساكارز.

اين محيط يك محيط كشت در جهت تشخيص افتراقي اعضا انتروباكترياسه براساس يكسري واكنش‌هاي تخميري قند هست و براساس تخمير اين سه قند در نواحي سطح و عمق محيط مي‌توانيم نتايج را بررسي و تفسير كنيم و با توجه به اينكه معرف اين محيط فنل رد است، رنگ اوليه آن به رنگ قرمز است و در صورتي كه تخمير قند در اين محيط صورت گيرد با توليد اسيدPH محيط هم اسيدي شده و امكان دارد كه واكنش اسيدي را در سطح يا عمق يا در هر دو بخش محيط مشاهده كنيم. همچنين در اين محيط واكنش قليايي يا استفاده از پپتون محيط را مي‌توانيم برحسب نوع باكتري ببينيم كه در اين صورت با تجزيه‌ي منبع ازتي يا پپتوني محيط عوامل قليايي كننده‌ي PH در محيط توليد مي‌شوند مثل عوامل آميني كه در اين حالت رنگ محيط قرمزتر مي‌شود. براساس اين نوع واكنش‌ها حالات مختلفي در تفسير نتايج TSI مشاهده مي‌شود كه براساس توليد اسيد و يا قليا در قسمت سطحي يا عمقي محيط گزارش مي‌شود كه مي‌توانيم به اين ترتيب گزارش دهيم.

 

يا مي‌تواند بصورت: ALK/ ALK يا قرمز (R) (K) قليايي-

در محيط TSI علاوه بر تخمير اين سه قند مي‌توانيد توليد H₂S يا سولفيد هيدروژن را هم در نواحي مختلف محيط مشاهده كنيد.

آهن رسوب سياه FeS مي‌دهد. علاوه بر توليد H₂S توليد گاز Co₂ ناشي از متابوليسم قند را مي‌توان ديد. براي مشاهده‌ي توليد گاز Co₂ اگر در سطح يا عمق محيط ترك خوردگي ايجاد شده باشد و يا محيط در لوله آزمايش جابجا شود نشانه‌هاي توليد گاز Co₂ هستند. يعني باكتري مورد آزمايش از تخمير قند بطور توأم اسيد و گاز توليد كرده مثل E. coli.

نكته مهم اينكه بررسي و تفسير نتايج اين تست را بايد حتماً بعد از h24 گرماگذاري بررسي كنيم. اگر از زمان h24 بگذرد واكنش‌ها تغيير مي‌كند.

 

استفاده از تست اورئاز: (urease test)

اوره از منابع ازتي يا نيتروژني هست كه برخي باكتري‌ها با آنزيمي بنام اورئاز، قابليت تجزيه و هضم آن را دارند و از تجزيه‌ي آنزيمي اين تركيب ماده آمونياك توليد شده كه باعث قليايي شدن محيط باكتري مي‌شود. باكتري‌هايي مثل پروتئوس در جنس‌هاي خانواده‌ي انتروباكترياسه هست اين آنزيم را بخوبي دارا مي‌باشند و اورئاز+ هستند لذا از اين صفت مي‌توانيم در شناسايي جنس‌ها و گونه‌هاي اين خانواده استفاده كنيم. براي آزمايش مقداري از باكتري را با فيلدوپلاتين استريل در محيط اوره براس و يا اوره آگار تلقيح مي‌كنيم. محيط‌ها را h24 در ^oC 37-35 گرماگذاري كرده و بعد از اين مدت اگر رنگ محيط كشت از صورتي اوليه به ارغواني پررنگ تغيير كرد نشان دهنده‌ي واكنش+ اورئاز است. يعني باكتري طي مكانيسمي كه گفته شد اوره محيط را تجزيه كرده و با توليد يون‌هاي آمونياك PH محيط را قليايي كرده و در اين PH رنگ معرف محيط به ارغواني تغيير كرده و در صورتي كه بعد از h24 گرماگذاري رنگ محيط تغيير نكند نشانه‌ي واكنش منفي اورئاز است.

استفاده از محيط‌هاي كشت انتخابي و افتراقي بنام selective differential media مثل محيط؛ E. MB agar، Endo agar و macconkey agar اين محيط‌ها بصورت جامد در پليت تهيه شده و كاربرد گسترده‌اي در آزمايشگاه ميكروب شناسي باليني دارند و بخوبي براي جداسا