مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

بررسي مقاله

نسخه برداري ويروس آنفولانزا:

مدت ها است مي دانيم که ويروس آنفولانزا حاوي چند مولکول RNAتک رشته اي مجزا است و در چند سال اخير به مدارک قطعي دست يافتيم که نشان دادند هر دو نوع ويروس A و B حاوي 8 زنجيره خاصي فيلونوکلئوتيد هستند.

اين نتيجه در مورد ويروس نوع A براساس اين مدارک بدست آمده با آناليز مستقيم شيميايي نقشه ريزي T– اليگونوکلئوتيد- Rnase و آناليز توالي نوکلئوتيد و بررسي هاي ژنتيکي مثل آناليز اجزاي RNA ويروس نوترکيب بدست آمد.

نتايج آزمايش اول امکان شناسايي ساير مولکول هاي کوچک RNA را به ما دادند که در بعضي نمونه هاي تکه 5 ترمينال يکي از بزرگترين تکه هاي ژنوم شناسايي شدند پس تا حدي ابهام مربوط به تعداد RNAهاي هر ژنوم حل شدند.

با تحقيقات ژنتيکي هم توانستيم A پلي پپتيد خاص ويروس در سلول هاي آلوده به ژن هاي RNA را شناسايي کنيم.

اين کار ابتدا با مقايسه سايز و اندازه ژن ها و محصولات شان و سپس با هيبريد قياسي و آناليز الکتروفورزژل پلي اکريلاميد روي اجزاي RNAويروس اصلي و نوترکيب حامل مارکرهاي ژنتيکي حساس به دما يا آنتي ژني ممکن شد. در نتيجه حضور محصولات دو سوم بزرگترين مولکول هاي RNAبا وزن ⁶ 10 در نسخه برداري و حضور پلي پپتيد سوم با اندازه مشابه در فعاليت نسخه برداري معلوم شد.

سه ژن با وزن بين ⁵ 10 ×6 و 8 حاوي اطلاعاتي براي سفتز و توليد پلي پپتيد نوکلئوکپسيد، سنتز دو پلي پپتيد کوچک و جزء غير ويروسي با عملکرد نامعلوم و پلي پپتيد ماتريکس ويروسي بودند که هر دو وزن حدود ³ 10 × 25 داشتند که به وسيله دو RNA کوچک با وزن تقريباً ⁵ 10 ×3 دالتون هدايت شدند.

پس ژنوم ويروسي آنفولانزا از 8 ژن RNA تک رشته اي با وزن ⁶ 10 و ⁵ 10×3 تشکيل شده است که حاوي اطلاعات لازم براي سنتز و توليد 8 محصول پلي پپتيد با اندازه مشابه است.

بيان اين اطلاعات در سلول هاي آلوده با نسخه هاي RNA توالي مکمل RNAهاي ژنوم تسهيل مي شود. و در ادامه اين مقاله به توصيف ماهيت اين مولکول ها و پروسه هاي سنتزشان و بحث در مورد وظايف شان در نسخه برداري ويروسي مي پردازيم.

بسياري از اين نتايج تجربي تازه بدست آمده از تحقيق روي عفونت فيبروبلاست هاي جنيني جوجه و سلول‌هاي L ويروسي طاعون مرغي بدست آمده اند. اولي سيستمي نخستي است و دومي موجب توليد ويروس عفوني شد.

متد استفاده شده براي آناليز محصولات نسخه برداري شامل شناسايي با فلوروگرافي مولکول هاي هيبريد دو رشته اي جدا شده و با الکتروفورز تشکيل شده با تابکاري RNAراديواکتيو بدست آمده از سلول هاي آلوده يا مخلوط واکنشي پلي مراز در حضور RNAويريون اضافي بدون ليبل است.

آناليزهاي ترکيب نسخه برداري عصاره هاي سلول آلوده با استفاده از رويکرد تحليلي به ما نشان دادند که دو دسته مجزا RNA مکمل در توالي (RNA ) RNA ويريون سلول هاي آلوده وجود دارد. آزمايشات بعدي نشان دادند که اعضاي يکي از اين دسته حاوي توالي هاي اسيد پلي ادنيليک است و به علاوه هيبريدهاي مقاوم به نوکلئاز ، S را با استفاده از RNA پلي ادنيلات بدست آورديم که با کروماتوگرافي رابطه تهيه شدند و در حقيقت کوچکتر از همتاهاي تشکيل شده با تابکاري RNA بدون پلي ادنيلات و RNA ويريون بودند.

اين ويژگي متمايز را بعداً با نقشه ريزي اليگونوکلئوتيد Rnosetقياسي بررسي کرديم. و مولکول‌هاي RNA ويريون راديواکتيو (RNAV ) را از بخش هاي RNA دو رشته اي هيبريدهاي تشکيل شده بين VRNA هاي ليبل دار و CRNA هاي پلي آدنيلات و بدون پلي آدنيلات بدست آورديم.

نتايج بدست آمده نشان دادند که CRNA هاي بدون پلي ادنيلات نسخه هاي کاملي ازRNA هاي ژنوم داشتند و CRNA هاي پلي ادنيلات نداشتند. به علاوه، مشاهده حساسيت نوکلئاز VRNAليبل دار در هيبريدهاي بدست آمده هم نشان داد که همه نسخه هاي پلي ادنيلات فاقد توالي هاي مکمل 5 ترمينال VRNAهستند. خلاصه، اين نتيجه با نتايج آناليز توالي اليگونوکلئوتيدهاي Rnasetiخاص VRNA7 و 8 تأييد شد که مقاوم به sنوکلئاز پس از هيبريد با CRNAپلي ادنيلات نداشتند.

يافته هاي ما نشان دادند که اليگونوکلئوتيدهاي توالي هاي به 5 ترمينالRNA هاي 7 و 8 نزديک هستند و به وسيله هضم sنوکلئاز از RNAويرويون در هيبريد با CRNAپلي ادنيلات حذف شده اند و آناليزهاي جديدتر توالي اين اليگونوکلئوتيدها را در موقعيت هاي 17 تا 29 و 17 تا 36 از 5 ترمينال مولکول هاي مورد نظر قرار دادند.

در مدت اين تحقيقات توالي نوکلئوتيد VRNA به ويژگي جالبي از ژنوم پي برديم. و معلوم شد که 5 ترمينال همه VRNAتا مدت ها PPPAP بود.

و همه آنها حاوي اوريدين در 3 ترمينال خود هستند به شباهت با اين يافته ها پي برديم که 23 نوکلئوتيد اول همه VRNA ها تقريباً يکسان بودند.

نتايج آزمايشات حفاظت از SI نوکلئاز نشان دادند که توالي مکمل اين منطقه در CRNA هاي پلي ادنيلات دار موجود نبودند. به آناليزهاي بيشتري براي تعيين مکان دقيقي که مکمل بين VRNA و CRNA هاي پلي ادنيلات متوقف مي شوند نياز است.

پس کلاً اين مشاهدات نشان مي دهند که دو دسته نسخه CRNA در سلول آلوده بر آنفولانزا وجود دارد که مولکول هاي فقط يک نوع حاوي پلي A هستند بر خلاف همتاهاي بدون پلي آدنيلات و اين مولکول ها حاوي توالي هاي مکمل در منطقه محفوظ در 5 ترمينال RNA هاي ويرويون نيستند.

نسخه اوليه ژنوم ويروسي آلوده کننده با عمل آنزيمي تسهيل شد که جزء اصلي عفونت هاي ذرات ويروسي است و به آن نسخه اوليه مي گويند نسخه ثانويه شامل همه فعاليت هاي بعدي سنتز است که CRNA توليد مي‌شود، در آزمايشگاه پس از تخريب غشاي ويروسي به وسيله دترژنت (شوينده)، آنزيم ويريون همه RNA ها را نسخه برداري کرد و دو خصوصيت داشت که اهميت خيلي زيادي دارند.

1- پلي مريزاسيون در بعضي نمونه هاي ويروسي تا 100 برابر در حضور پرايمرهاي دي نوکلئوتيد مثل CIPG و APG تحريک مي شود که با 5 ترمينال نسخه ها تلفيق شده اند.

2- محصولات واکنش نسخه هاي ناکاملي از RNA هاي ويريون هستند. آنها پلي ادنيلات شده هستند و مشابه نسخه هاي پلي ادنيلات شده بدست آمده از سلول هاي آلوده هستند. به اين دو ويژگي بعداً‌ اشاره مي کنيم.

در آزمايشگاه با اطلاعات توصيف شده در بالا در مورد ماهيت دو دسته RNA مکمل در سلول آلوده به ويروس مرغي توانستيم سينکيک هاي سنتز و مکان زير سلولي آنها را شناسايي کنيم تا وظيفه آنها در نسخه‌برداري را شناسايي کنيم.

سنتز RNA خاص ويروس در سلول آلوده به ويروس مرغي با حداکثر سرعت بين 1و 3 پس از عفونت روي داد و طبق اين يافته است که %90 VRNAها سرانجام با ذرات ويروس پروژني توليد شده از 4 ساعت عفونت تلفيق مي شوند.

به علاوه مي توان نشان داد که در اين زمان ها پس از عفونت همه VRNAها با سرعت يکسان توليد مي‌شوند. و اين مشاهدات را در رابطه با توليد CRNA هاي بدون پلي ادنيلات در چند سيستم سلول آلوده هم بدست آورديم.

هر چند برخلاف اين نتايج، سرعت نسبي تشکيل CRNA هاي پلي آدنيلات متفاوت در زمان هاي مختلف پس از عفونت فرق داشت. در فيبروبلاست هاي جنيني جوجه آلوده، محصولات اوليه نسخه برداري شامل مقدار برابري از هر نسخه هستند.

بعداً طي توليد تغيير کرد به طوريکه هر CRNA پلي ادنيلات با حداکثر سرعت 8 ، 1، 2، 3، 5 توليد شده و سرانجام 4، 6، 7 به علاوه، بزرگترين نسخه هاي ژن هاي 1، 2، 3 پس از مراحل اوليه عفونت به مقدار خيلي کمتري از بقيه توليد شدند.

سلول آلوده به ويروس طاعون مرغي در اين عفونت دوره متفاوتي داشت. در اين عفونت، نسخه‌هاي سه ژن بزرگتر ابتدا به حداکثر سرعت توليد رسيدند به ترتيب ژن هاي 8، 7و 4 نسخه ژن هاي 6و 7 در همه مراحل عفونت ديده شدند. اين تفاوت طرح نسخه برداري ويروس در سلول‌هاي آلوده شده متفاوت را دوباره مشاهده کرديم. و به تفاوت هاي سينتيک سنتز نسخه هاي پلي ادنيلات و بدون پلي ادنيلات تأکيد کرد.

تفاوت هاي بين CRNAاين دو دسته را وقتي مشاهده کرديم که مکان سلولي شان را تعيين کرديم. هر چند همه آنها در سيتوپلاسم موجود بودند و CRNA هاي پلي ادنيلات فقط با پلي زوم ها همراه بودند. در نتيجه، هر چند سيستم توليد پروتئين بدون سلول هر نسخه هاي پلي ادنيلات و بدون پلي ادنيلات مثل RNA هاي پيام آور عمل مي کنند.

ولي به نظر مي رسد که در اين عفونت در بافت زنده براي مولکول هاي سابق محفوظ شده است. در مورد سايت توليد، مدارک متناقضي موجود است که دوباره بر تفاوت در سيستم هاي سلول- ويروس استفاده شده اشاره مي کنند.

هر چند مشاهدات کروگ و همکارانش که نشان دادند RNA هاي پيام آور ويروسي علاوه بر گوانوزين 7- متيل 5- ترمينال در ساختار cap حاوي N– متيل ادنوزين داخلي هستند که در حال حاضر نشانه اين است که آنها در هسته در طول نسخ برداري توليد شده اند.

سپس با خلاصه کردن اين دو دسته CRNA توانستيم سلول آلوده به ويروس آنفولانزا را بر مبناي ساختار اوليه مکان سلولي زمان هاي متفاوت پس از عفونت و سرعت نسبي توليدشان متمايز کنيم. کلاً اين خصوصيات متمايز نشان مي دهند که CRNA پلي آدنيلات متل الگوي هاي نسخه برداري ژنوم عمل مي کنند که همتاهاي پلي ادنيلات ناکامل شان اين وظيفه را ندارند.

نتايج آناليز سنتز پروتئين در سلول هاي آلوده بر ويروسي که نشانه فراواني RNA پيام آور در زمان هاي متفاوت پس از عفونت هستند طبق اين پيشنهاد هستند که مولکول هاي پلي ادنيلات مثل RNA پيام آور عمل مي کنند. به تغيير ميزان توليد پروتئين هاي خاصي ويروسي و زمان پس از عفونت که با حداکثر سرعت توليد شده اند در عفونت هاي ويروس آنفولانزا پي برديم.

در سلول هاي جوجه آلوده به ويروس طاعون مرغي نتايج نشان دادند که محصول پلي پپتيد بدون ويريون RNA را مي توان در زمان هاي اوليه پس از عفونت شناسايي کرد که ولي در واقع با حداکثر سرعت در زمان‌هاي بعدي پس از عفونت شناسايي مي شود که هماگلوتينين، نورامينيداز و پروتئين ماتريکس در اوايل عفونت شناسايي نشدند و حداکثر سرعت توليدشان در اواخر عفونت بود تا پلي پپتيد نوکلئوکيسيد ديتاهاي مربوط به زمان توليد اين سه پلي پپتيد بزرگ هنوز بدست نيامده اند.

هر چند آنها را مي توان از هم جدا کرد و رزلوشن آنها از اجزاي ميزبان هنوز بهبود نيافته است و آنها فراوان ترين پلي پپتيدهاي خاص ويروس هستند. هر چند از ديتاهاي موجود مي توان نتيجه گيري کرد که سرعت توليد و سنتز سومين پلي پپتيد بزرگ در اوايل عفونت کاهش مي يابد تا دو محصول ديگر ژن بزرگ.

اين نتايج حداقل براي پلي پپتيدهاي بدون گليکوزيلات دقيق هستند و بيانگر جمعيت هاي CRNA پلي آدنيلات سلول هاي خاص پس از مراحل اوليه عفونت هستند و طبق اين فرض هستند که مولکول هاي اين دسته از CRNAها مثل RNA هاي پيام آور عمل مي کنند. در عين حال آنها نشان مي دهند که بيان کنترل شده اطلاعات ژنتيکي ويروس که با توليد پروتئين خاص ويروس معلوم مي شود در سطح نسخه برداري ژنوم موجود است.

اين مورد چگونه بدست مي آيد؟ در حال حاضر بيشتر پيشنهادات مربوط به مکانيسم کنترل نسخه برداري از نتايج آناليز عمل بازدارنده هاي RNA و سنتز پروتئين در تکثير ويروس بدست آمده‌اند.

نسخه برداري در حضور سيکلوهگزاميد منوط به عمل پلي مراز ذره ويروس آلوده کننده است که در بالا توضيح داديم و موجب توليد RNA پيام آور شد و به آن نسخه اوليه مي گويند. پيشنهاد اول از نتايج آناليز پلي پپتيد توليد شده پس از حذف باز دارنده توليد پروتئين در سيستم سلول جوجه- ويروس طاعون مرغي بدست آمده است که اين پروسه نسخه برداري اوليه انتخابي بود.

اين مورد در چند نمونه ديده شد چون نتايج آزمايشات بعدي نشان دادند که محصولات اوليه نسخه برداري اين سيتسم از محصولات عفونت ويروس در سلول هاي L متفاوت هستند که در نبود توليد پروتئين هم ديده شد.

اين تغييرات مخصوصاً در رابطه با نسخه RNA در عفونت هاي ساير سلول ها به ويروس ها طاعون مرغي هم ديده شدند. پس نسخه اوليه محدود خصوصيت محض ويروس آلوده کننده نبود بلکه بازتاب واکنش نامعلوم بين ويروس و سلول بود.

توليد RNA الگوي در تکثير ژنوم يکي از وظايف آلوده کننده ژنوم- نسخه برداري است ولي در حال حاضر مکانيسم تبادل بين سنتز RNA نمونه و پيام آور معلوم نيست. از آناليز مستقيم RNA توليد شده در حضور سيکلومگزاميد که فقط RNA هاي پيام آور توليد مي شوند مي توان نتيجه گيري کرد که پروتئين هاي تازه توليد شده با ميزبان يا ويروس نياز هستند تا نسخه برداري کامل شود.

در حقيقت لازم به ذکر است که توليد پيوسته RNA الگو و در نتيجه VRNAبه توليد پروتئين وابسته است.

عملکرد پيوسته کمپلکس نسخه برداري ديتا در توليدRNAالگو براي توليد ژنوم مستلزم وجود پروتئين تازه توليد شده است و معلوم شد که پروتئين هاي خاص ويروس نقش دارند و با اين مشاهده ساپورت شد که جهش‌هاي دو گروه مکمل 29 ts و 131 که نسخه برداري اوليه را انجام مي دهند نمي توانند RNA الگو بسازند.

در اين رابطه به نتايج چند آزمايش اشاره شد که نسخه برداري پس از برگشت بلوک سيکلوهگزاميد با استفاده از محيط بدون سيکلوهگزاميد حاوي اسيد آمينه آنالوگ 5 p– فلوروفنيل آلانين ديده شده است.

تحت اين شرايط نسخه برداري کامل نيست حتي با بازگشت سنتز و توليد پلي پپتيد. هر چند طرح نسخه‌برداري RNAتغيير کرد. به جاي اينکه نسخه اوليه خاص اين سيستم که حاوي هر 8 RNA پيام آور است توليد شود طرح نسخه برداري مشابه با آن بعداً در عفونت نرمال روي داد. پس به نظر مي رسد که نسخه برداري به وسيله پلي مراز ديتا را مي توان با پروتئين هاي تازه توليد شده تغيير داد.

ميزان توليد RNA پيام آور در نسخه اوليه و RNA توليد شده در عفونت نرمال مشابه هم است و اين احتمال وجود دارد که پس از راندمان اوليه توليد RNA پيام آور، کمپلکس پلي مراز ديتا اصلاح شود تا RNA الگو توليد شود و در حقيقت در نسخه ثانويه حضور ندارد. در اين مورد پروسه دوم وظيفه محض RNA ژنوم تازه توليد شده و مولکول هاي پلي مراز تازه توليد شده نيست بعداً دوباره به اين احتمالات اشاره مي کنيم.

توصيف نسخه اوليه و ثانويه بالا به اثر سلول ميزبان روي فراواني نسبي RNA هاي پيام آور توليد شده تأکيد مي کند. که يکي از چند پيام برهم کنش بين ويروس و ميزبان در طول نسخه برداري ويروس است.

نتايج آزمايشات انجام شده روي سلول هاي آلوده انکوبات شده در حضور اکتينومايسين D و X– آملينيتين نشان مي دهند که ويروس آنفولانزا خاص است چون به نسخه برداري DNA براي تکثيرشان نياز دارد بدون استفاده از DNA خاص ويروس که واسطه نسخه برداري است.

پس دوباره عملکرد دقيق آن معلوم نيست بلکه از نتايج آزمايشات با استفاده از سيکلوهگزاميد به توليد پروتئين نياز نبود، در اين رابطه شبيه سازي قبلاً عنوان شده نسخه برداري در آزمايشگاه به وسيله پرايمرها بيانگر نياز آنزيم هاي خاص ويروس به اين مولکول ها است.

آناليزهاي قياسي توالي هاي 5 ترمينال CRNA و 3- ترمينال VRNA اين نکته را نشان مي‌دهند.

خلاصه اجزاي اصلي کنترل نسخه برداري ويروس هنوز معلوم نيستند. ولي ميزبان هميشه به سنتز RNA نوکلئوپلاسمي حتي براي نسخه اوليه نياز دارد که با استفاده از سلول هاي جهشي يافته مقاوم به X– آمانيتين معلوم شد به توليد پيوسته پروتئين خاص ويروس و ميزبان براي توليد RNA الگو نياز است و پروتئين هاي مختلفي در تنظيم سنتز RNA پيام آور نقش دارند.

در رابطه با مکانيسم هايي که در کنترل نسخه برداري نقش دارند چند مشاهده متفاوت بدست آورديم. از يک طرف،‌ مدارکي هستند که به کنترل سنتز RNA پيام آور اشاره مي کنند و از طرف ديگر مدارکي هستند که به متمايز سازي بين سنتز RNA الگو و پيام آور اشاره مي کنند.

در رابطه با اولي اطلاعات کمي موجود است. و فرض مي شود که در بيشتر موارد، شروع نسخه برداري پروسه‌اي است که کنترل مي شود و اين احتمال وجود دارد که ممانعت از D اکتينومايسين به خاطر ممانعت از توليد پرايمر طبق اين فرض است.

معلوم نيست ويروس حساس به P– فلوروفنيل- آلانيت يا محصول ميزبان در تغيير نسبت RNA پيام آور انتخابي باشد ولي اصلاح خصوصيت نسخه برداري در شروع صحت دارد.

همه ساير مشاهدات ثبت شده شامل 3- ترمينال RNA پيام آور هستند که موجب توليد ناکامل نسخه برداري مي شوند. همچنين توليد قبل از تکه شدن نسخه مناطق 5- ترمينال ژنوم پايان مي‌يابد.

پس RNA هاي پيام آور نسخه هاي پيوسته RNA هاي ژنوم نيستند. از نتايج تعيين توالي هاي حساس و مقاوم نوکلئاز در هيبريد RNA پيام آور VRNA به نظر مي رسد که شواهد آزمايشي قطعي موجود نيستند تا بتوان بين دو احتمال اول تمايز قائل شد. هر چند اين مشاهده که در آزمايشگاه و دريافت زنده در نبود سنتز پروتئين فقط RNA هاي کاملاً پلي آدنيلات نشده توليد مي شوند نشان مي دهند که پايان زود هنگام يکي از مکانيسم‌هاي محتمل است.

اگر اين مورد تأييد شود پس به پروتئين هاي تازه توليد شده براي توليد نسخه هاي کامل نياز است تا نسخه‌برداري در سايت پايان RNA پيام آور پيش رود نه در ممانعت از پردازش نسخه هاي کامل.

موقعيت دقيق پايان RNA پيام آور هنوز معلوم نشده است ولي احتمالاً در منطقه 17 رزيدو است. توالي 76 بين موقعيت 17 و 22 بيانگر سيگنال پايان است و در اين رابطه توالي هاي مشابهي در پايان نسخه هاي پروکاتيوني ديده شده است. در اين رابطه مي توان گفت که نوکلئوتيدهاي 3- ترمينال نسخه هاي کامل مثل توالي شناسايي در پيوند رپليکاز عمل مي کنند که در پروسه انتخاب مکمل ژنتيکي مولکول هاي VRNA در تکثير و نوترکيب نقشي داشته اند.

مشاهدات فقط اين توالي در RNAهاي ويرون همه نمونه هاي آنفولانزا طبق حضورشان در اين وظايف هستند.