مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

همه چیز درباره PCR

 

 

 

اطلاعات اولیه

 

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.

 

PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.

 

تاریخچه

 

در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.

 

مراحل PCR

 

· مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.

 

· مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود. ما بین دو پرایمر ساخته می‌شود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.

 

· مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ادامه PCR بعد از چرخه اول

 

بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه ، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است.

 

کاربردهای مهم PCR

 

· تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.

 

· بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.

 

· تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.

 

· تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

 

تشخیص بیماریها

 

کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟

 

 

 

 

 

 

 

مشکل PCR و راه حل آن

 

اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

 

یکی از روش‌های پیشنهادی انجام PCR داخلی یا Nestied PCR است. از این روش با استفاده از دو پرایمر قطعه‌ای از DNA را تکثیر می‌دهند و سپس قطعه‌ای دیگر در داخل DNA‌های تکثیر شده PCR می‌شود. بدین صورت احتمال آلودگی کاهش می‌یابد.

 

روش‌هاي تغييريافته ‏PCR‏ و كاربرد اين روش‌ها در شناسايي و درمان

 

 

واكنش زنجيره‌هاي پليمراز (‏PCR‏) روشي است براي تكثير اختصاصي قطعات ‏DNA‏ كه نخستين بار در سال 1985 گزارش شد. در اين روش قطعه‌اي از ‏DNA‏ به طور انتخابي با به‌كارگيري دو پرايمر اوليگونوكلوئوتيدي و آنزيم پليمراز ‏Tag‏ مي‌توان تا ده هزار برابر تكثير كرد. هريك از اين دو پرايمر به رشته‌هاي مخالفشان در روي ‏DNA‏ هدف متصل شده و مكان آنها به‌گونه‌اي است كه سنتز زنجيره ‏DNA‏ توسط آنزيم پليمراز تنها در ميان دو پرايمر انجام مي‌گيرد.

 

‏

از آنجا كه زنجيره‌هاي تازه ساخته شده خود مكمل پرايمرها است، اين چرخه مي‌تواند پس از يك مرحله واسرشته شدن زنجيره‌هاي ‏DNA‏ از هم تكرار شود. به عبارتي ‏PCR‏ روشي است براي يك برنامه دوره‌اي مشتمل براي تكرار گرم و سرد كردن و ‏DNA‏ به‌كمك يك آنزيم ‏DNA‏ پليمراز مقاوم به گرما و يك جفت پرايمر تحت تكثير انتخابي قرار مي‌گيرد و از طريق اين روش ‏DNA‏ به صورت تصاعد هندسي زياد مي‌شود. امروزه روش ‏PCR‏ جايگاه بسيار مهمي را در جنبه‌هاي مختلف مهندسي ژنتيك، بيولوژي مولكولي، ميكروب‌شناسي تشخيصي تشخيص سرطان و بيماري‌هاي ژنتيك، تشخيص هويت، جرم شناسي (پزشكي قانوني جهت تشخيص منشأ نمونه اسپرم، خون و ...) تعيين ترادف، باستان‌شناسي، مطالعات تكاملي موجودات و ... پيدا كرده است. كاربرد بيشتر و دقيق‌تر تكنيك ‏PCR‏ در تشخيص، روش‌هاي تغيير يافته‌اي از آن به وجود آمده است كه به تعدادي از آنها اشاره مي‌شود.

 

 

مالتيپلكس پي سي آر (‏Multiplex-PCR‏)‏

‏ يكي از روش‌هاي تغييريافته ‏PCR‏ است كه در آن تنها يك جايگاه ژني مورد بررسي قرار مي‌گيرد، با استفاده از پرايمرهاي مختلف مي‌توان چندين جايگاه را مورد بررسي قرار داد و از چندين جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير استفاده مي‌شود. كاربردهاي اين روش مي‌تواند شامل موارد زير باشد: ‏

‏1) بخش‌هاي بزرگي از يك ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوي تغييرات مي‌تواند بررسي شود. براي مثال كشف نقص‌ها در بيماري ديستروفي عضلاني روشن يا كشف بخش‌هاي مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مايكروباكتريوم توبر كلوزيس عامل بيماري سل، ‏

‏2) بخش‌هاي غيرمربوط به هم در ژنوم هدف مي‌تواند مورد آزمايش واقع شود و‏

‏3) مي‌توان از طريق اين روش با پرايمرهاي مختلف به جست‌وجوي عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسايي عوامل شايع مننژيت. اين روش بيشتر براي شناسايي جايگاه‌هايي از ژن‌ها به كار مي‌رود كه انواع زيادي از جهش در آنها به وقوع مي‌پيوندد.‏

 

 

آرتي-پي‌سي آر (‏RT-PCR‏)‏

‏ اين روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن ‏RNA‏ است. اولين مرحله در اين روش تبديل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏DNAاي كه مكمل توايس‌هاي ‏mRNA‏ است) توسط آنزيم نسخه‌بردار معكوس صورت مي‌گيرد (‏RT‏). برخي از موجودات مانند برخي از ويروس‌هاي ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضي از ويروس‌ها مانند ويروس هپاتيت ‏B‏ هرگز به شكل ‏DNA‏ مابين در اثر آنزيم نسخه‌بردار معكوس درنمي‌آيد. آنزيم نسخه‌بردار معكوس (‏RT‏) در اين روش از "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.

كاربرد اين آنزيم به‌دليل آن‌كه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام "ترموس ترموفيلوس" يك ‏DNA‏ پليمر از مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود يافت كه در حضور يون ‏Mn+2‎‏ داراي فعاليت نسخه‌برداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته مي‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي (‏EGTA‏) حذف مي‌شود و سپس اين آنزيم از ‏DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي‌كند.‏

 

 

آرمز پي‌سي‌آر (‏ARMS-PCR‏)‏

‏ اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهش‌هاي نقطه‌اي است. در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده مي‌شود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله‌ حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است. اين روش نام‌هاي ديگري نيز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏

 

 

نستد پي‌سي‌آر (‏Nested-PCR‏)

در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده مي‌شود، طوري كه جفت دوم در بني جفت اول جاي مي‌گيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير مي‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌اي ديگر منتقل مي‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف كوچكتري از ‏DNA‏ كه درون ‏PCR‏ اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير مي‌شود.‏

مزاياي اين روش تغيير يافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1) نياز به پروب (كاوشگر) و تأييدهاي بعدي كمتر است، 2) حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است و 3) به دليل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جديد، ممانعت كننده‌ها رقيق مي‌شود. اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق توانسته‌اند بيماري‌هاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار جلوگيري كنند.‏

همچنين ويروس "سيتومگالوويدوس" كه مي‌تواند سبب ناشنوايي در 1% از كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق امكان‌پذير است. جنين‌هاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين روش تشخيص داده شدند.

 

 

‏Real-Time PCR

‏ به علت ورود نسل جديدي از ترموسايكلرها با سيستم فلورومتري كه اجازه پايش پيوسته خاصيت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را مي‌دهد، اين روش ابداع شد. در اين روش از كاوشگرها يا پروب‌هاي هيبريداسيون نشان‌دار شده با رنگ‌هاي فلورسانس در انتهاي 5 يا 3 استفاده مي‌شود. كه امكان پايش پيوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازي آنها در روش‌هاي الكتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد مي‌دهد. اين سيستم در سال 1992 كشف شد. اين روش به دليل كاهش زمان سيلك‌هاي ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و كاربرد نشانگرهاي فلوروژنيك و روش‌هاي حساس آشكارسازي تابش آنها باعث افزايش سرعت اين سيستم نسبت به سيستم ‏PCR‏ معمولي شده است. سازندگان و كاربران اين روش سعي مي‌كنند محصول ‏PCR‏ كوچك‌تر طراحي كنند تا سرعت افزايش يابد اما تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهينه نمي‌كند. البته اين روش داراي معايبي نيز است از جمله مي‌توان به عدم ناتواني در مشخص كردن اندازه محصول بدون باز كردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرم‌ها با شيمي برخي رنگ‌هاي فلورژنيك اشاره كرد. براي شناسايي بسياري از ويروس‌هاي عامل بيماري‌هاي انسان از اين روش استفاده شده است. ‏

 

مراجع:‏

1. Guven.S,Yilmaz. E,kutby.H and eta. The Diagnostic Value of Polymerase chain Reaction (PCR) in Bronchialveolveolar Lavage. Eastern Journal of Medicine 9(1): 07-12, 2004

2. Maeda.S and etal. Helicobacter Pylori specific nested PCR assay for the detection of 23 S rRNA mutation associated with clarithomycin resistance. Gut.bmj.com.2007

3. Pusterla.N and etal. Real time polymerase chain Teaction: A Novel Molecular Diagnostic Tool for equine Infectious Disease. Journal vet International Medical; 20:3-12, 2006.

4. Salto‎-Telez M,etal. Multiplex RT-PCR for the Detection of Leukemia-Associated Translations. Journal of Molecular Diagnostic; 54):231-236, 2003.‎

5. Vakulenko.S.B and etal. Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Redsistance Gene in Enterococci. Animicrobal agents and chemotherapy;‎ 47(4)1423, 2003.

6. Hajbeigi.H and Radpour.R. Gentic Terminology Book. First edition. 424 Page 2002