مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

در این تحقیق با طرز انجام آزمایشات زیر آشنا خواهيد شد:

سالمونلا :

تست اسلایدی

تست لوله ای

تضعیف فاز

جذب

تست ویدال(اسلایدی، تست لوله ای o و تست لوله ایH)

شیگلا

تست اسلایدی

تست لوله ای

اشریشیا

تست اسلایدی

تست لوله ای

 

تکنیک هاي آزمایش شیگلا ،سالنمونلا و اشریشیا که در اینجا بحث می شوند سابقه ی کافی داشته و تائید شده اند. شکلهای تغییر یافته ای از این آزمایشات وجود دارند، ولی قبل از استفاده ی روتین انها سرولژیست باید احتاط کافی نموده و باندازه کافی جنبه های مختلف آنها را مطالعه کرده باشد.

سالمونلا

روش1: تست اسلایدی آگلوتیناسیون

طرز آزمایش:

1- با استفاده از یک ماژیک روی یک اسلاید شیشه ای تمیز در ناحیه را علامت بگذارید. در کنار یک ناحیه حرفT (test) و در کنار ناحیه ی دیگر حرفC(control) را بنویسید.

2- با یک لوپ 3 میلی متری، 3 لوپ پرسالین را روی ناحیه یT،و 2 لوپ پر را روی ناحیه ی c بگذارید.

3- مقدار کافی باکتری را از روی محیط(Triple sugar Iron agar or infusion agar) برداشته و با سالین روی دو ناحیه یT،C مخلوط کنید تا سوسپانسیون غلیظ حاصل شود. (سوسپانسیون روی اسلاید باید ظاهر شیری داشته باشد).

4- یک لوپ کامل از سروم مناسب را به سوسپانسیون تست و بسرعت با لوپ مخلوط کنید(به ناحیه ی) چیزی اضافه نمی شود).

5- اسلاید را در مقابل یک زمنه ی تاریک گرفته و به آرامی بچرخانید.

6- آگلوتیناسیون اختصاصی باید طی 1 دقیقه ایجاد شود، سوسپانسیون کنترل باید هوموژن باقی بماند.

 

بحث:

1. کلنی خشن (R) برای هیچ تست آگلوتیناسیوی مناسب نمی باشند. برای تعیین خشن بودن یک کلنی آن را در محلول 500/1 تریپانلاوین یا آکریفلاوین وارد کرده و مخلوط می کنیم، اگر کلنی از نوعR باشد اتوآگلوتیناسیون می دهد.
2. ازآگلوتینایسونی که بعد از 1 دقیقه رخ می دهد صرف نظر می شود (به خصوص وقتی که این
   آگلوتینه ها تا 3 دقیقه بزرگتر نشوند). نتایج مشکوک باید با تستهای آگلوتیناسیون لوله ای چک گردند زیرا احتمال واکنش های متقاطع در لوله کمتر است. نتایج بدست امده با سوسپانسیون آنتی ژنی تهیه شده از محیطbile salt باید با آنتی سروم های رزرو تائید گردند.
3. حجم های ریجنت باید حداقل باشد تا مانع از واکنش متقاطع گردد.
4. در مجاورت یک جار گندزدا کار کنیدف و پس از پایان آزمایش اسلایدها را در جار بیاندازید یا
   می توانید از سوسپانسیون های الکل دار O یا سوسپانسیون های فرمالین دار H استفاده کنید.

روش2: تست آگلوتیناسیون لوله ای

تهیه ی سوسپانسیون آنتی ژنH

1- با استفاده از یک سوزن باکتری را در محیطbroth infusion تلقیح نموده و 24 ساعت انکوبه کنید. کشت را با قسمتهای مساوی فرمل- سالین6/0 در صد رقیق کنید یا

2- باکتری را در محیطinfusion broth تلقیح نموده و برای4 ساعت انکوبه نمائید. 3 قطره فرمالین اضافه کرده و سپس با آبگوشت استریل رقیق کنید تا کدورت محیط برابر با کدورت شماره 1 لوله Brown گردد(در این حالت در هر میلی لیتر از محیط 750 میلیون باکتری وجود خواهد داشت).

 

تهیه ی سوسپانسیون آنتی ژنO

1- کلنی های باکتری را از محیطinfusion agar برداشته و در الکل اتیلیک مطلق، معلق سازید و 1 ساعت در C60 حرارت دهید، سپس 10 دقیقه سانتریفوژ کنید تا باکتری ها بصورت رسوبی رد ته لوله قرار گیرند و بتوانید الکل آن را بیرون بریزید. با سالین مجدداً سوسپانسیونی بسازید که کدورت آن مطابق کدورت لوله ی شماره1 Brown باشد(750 میلیون باکتری در هر میلی لیتر).

یا

2- مقداری از کلنی های روی محیطinfusion agar را به یک لوله ی آزمایش حاویml 5/0 سالین منتقل کرده آن را ببندید. لوله را به مدت 10 دقیقه در حمام اب جوش قرار داده و سپس رقیق کنید تا کدورت لوله برابر کدورت لوله شماره 1 براون گردد(750 میلیون باکتری در هر میلی لیتر).

طرز آزمایش

1- سروم مناسب را با سالین نرمال به اندازه رقیق کنید.

2- ml5/0 از این سروم رقیق شده را به یک لوله ی تمیز خشک منتقل نموده و به آن ml5/0 از سوسپانسیون آنتی ژن را اضافه کنید.

3- لوله های مربوط به آگلوتیناسیون H را به مدت 2 ساعت درc50 ،و لوله های مربوط به آگلوتیناسیونO را به مدت 4 ساعت درc50 انکوبه نمائید.

بحث: به جز موقعی كه می خواهیم آنتی ژن های نزدیک به هم را تشخیص دهیم، فقط یک رقت مورد نیاز است.( در مورد تشخیص آنتی ژن های نزدیک به هم باید سروم را چندین بار رقیق نموده و رقت های مختلف ساخت)

یک لوله کنترل سالین با سوسپانسون آنتی ژن نیز استفاده می شود تا مشخص شود سوشی که سوسپانسیون آنتی ژن را از آن ساخته اند اتوآگلوتینه نمی شود، این لوله به عنوان لوله کنترل منفی نیز عمل می کند.

لوله ها باید طوری در حمام آب قرار گیرند که تقریباً یک سوم مایع داخل آنها بالای سطح حمام قرار گیرد.

روش 3: تکنیک تضعیف فاز

The technique of phase supperession

طرز آزمایش

1- ml 5 infusion agar (2/0 تا 5/0 درصد) را حرارت دهید تا ذوب شود و سپس آن را تا 48 تا c 50 سرد کنید.

2- دو قطره سروم فاز یک یا دو ( بسته به فازی که می خواهیم مهار کنیم)، را به این محیط مذاب اضافه کرده، مخلوط نموده و سپس بدقت یک لوله استریل خشک (با دو انتهای باز که انتهای پائینی آن دندانه دار است) را داخل آگار قرار دهید( توجه: این لوله باید حد اقل 1/2 اینچ بالاتر از سطح آگار قرار گیرد ) باید دقت کرد که ذرات آگار ببالای این لوله (با دو سر باز) نپاشد. حال با استفاده از یک سوزن استریل باکتری را در سطح آگار بکارید( باکتری باید از محیط infusion agar که نصف آن با infusion broth پوشیده شده است برداشت شود، سطح شیب دار این محیط در صورت مرطوب بودن باعث تسهیل حرکت و رشد باکتری های ناژک دار می گردد. نباید از محيط broth به تنهایی استفاده کرد زیرا سالمونلا ها در آن بسیار کم رشد می کنند).

3- لوله را 24 ساعت در c 37 انکوبه نمایید ( به هنگام انکوباسیون، آنتی بادی سروم در آگار سالمونلا های دارای آنتی ژن های همولوگ را بی حرکت نموده و فاز دیگر را می توان از سطح آگار خارج لوله شیشه ای جدا نمود.

4- با یک پی پت استریل، مقدار کمی infusion agar را برداشته و در شرایط آسپتیک به محیط infusion broth infusion agar دیگر که نیمی از شیب آن با آبگوشت پوشیده شده منتقل کنید.

5- لوله های آبگوشت را 24 ساعت دیگر در c 37 انکوبه کنید.

بعد از انکوباسیون می توان از لوله های کشت آگار یا آبگوشت را برای تعیین فاز استفاده نمود. اگر آگلوتیناسیون فاز بدست آمده با آنتی سروم مربوطه نارضایت بخش باشد، کشت ممکن است به پاساژ اضافی (از طریق لوله craigie نیاز داشته باشد) کشت بدست آمده از لوله craigie را می توان به عنوان منبع باکتری برای پاساژ های بعدی استفاده کرد.

 

متد4: تکنیک جذب

طرز آزمایش

1- در پلیت های infusion agar ضخیم و مرطوب ml 5/0 از کشت آبگوشت 24 ساعته سوش جذب کننده را بکارید.

2- پتری دیش ها را ، در حالیکه سطح محیط داخل آنها رو به بالا است، برای 24 ساعت انکوبه کنید.

3- بعد از انکوباسیون، روی محیط ها محلول سالین- فنل 25/0 درصد ریخته و کلنی های سطح آنها را تراشیده و داخل یک لوله سانتریفوژ بریزید.

4- این لوله را برای 15 دقیقه دز دور بالا (2000 تا Rpm 3000) سانتریفوژ کرده و سپس مایع رو را دور بريزيد.

5- Ml0/1 محلول سالین- فنل را روی رسوب داخل لوله سانتریفوژ ریخته و تکان دهید تا باکتری ها مجدداً بحال معلق در آیند.

6- سرومی که باید جذب شود را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید.

7- 2 ساعت در c 50 انکوبه کنید.

8- بعد از انکوباسیون، سانتریفوژ نموده و سروم جذب شده را جدا کنید.

9- سروم جذب شده را در مقابل سوسپانسیون سوش جذب کننده و یک یا دو سرو تایپ دارای فاکتور های انتخاب شده تیتر نمایید. این چک در مقابل سوش جذب کننده ما را مطمئن می سازد که آیا جذب به طور رضایت بخش انجام شده یا خیر. چک کردن در مقابل سروتایپ های انتخابی برای مطمئن شدن از تیتر فاکتور های انتخاب شده می باشد. اگر آنتی سروم جذب شده در تستهای اسلایدی استفاده می شود، آزمایش های مربوط به چک کردن نیز باید روی اسلاید انجام شوند.

 

روش پنجم: تست ویدال ( اسلایدی و سریع)

طرز آزمایش:

1- 8/0 ، 04/0 ، 01/0 ، ml 005/0 از سروم های مورد آزمایش و کنترل را با پی پت روی نواحی جداگانه اسلاید شیشه ای که طرف دیگرش سیاه است بریزید.

2- یک قطره از سوسپانسیون آنتی ژن مناسب ( بصورت رقیق نشده) را به هر کدام از سروم ها اضافه کنید( توجه داشته باشید که آنتی ژن را قبل از اضافه کردن خوب تکان دهید تا ذرات آن بصورت معلق در آید) رقت های نهایی سروم عبارتند از 1:40 ، 1:80 و 1:320 .

3- با شروع از بالاترین رقت و حرکت بسوی رقت هاب پایین تر با استفاده از یک چوب اپلیکاتور هر کدام از سوسپانسیون ها را مخلوط نمایید.

4- پلیت شیشه ای را یک دقیقه به جلو و عقب حرکت داده و سپس زیر لامپ نتیجه را بخوانید.

5- اگر آگلوتیناسیونی دیده شود آن را با تست لوله ای تائید کنید.

روش6: تست ویدال

(روش تست لوله ای "O")

طرز آزمایش:

1- هشت لوله ی آزمایش را در یک رک بچینید.

2- به اولین لولهml 9/1 محلول سالین- فنل 25/0 در صد را اضافه کنید. به هفت لوله ی باقیمانده ml0/1 محلول سالین ،فنل اضافه کنید.

3- Ml1/0 از سروم بیمار را به لوله ی 1 اضافه نموده، مخلوط کرده و ml 1 از آن را به لوله 2 منتقل کنید. این کار را برای هر لوله تکرار کرده و بالاخره ml 1 از مخلوط داخل لوله 7 را دور بریزید. بنا براین رقتهای نهایی لوله ها 1:20 تا 1:1280 خواهد بود. لوله 8 به عنوان کنترل استفاده می شود( توجه: یک کنترل مثبت باید همراه سروم بیماران گذاشته شود برای این منظور باید از آنتی سروم پلی والان o سالمونلا استفاده کرد)

4- Ml05/0 از سوسپانسیون آنتی ژن مربوط را در تمام لوله ها بریزید و با تکان دادن رک (ها) محتویات داخل لوله را مخلوط نمایید.

5- لوله ها را تا 2 ساعت در c 37 انکوبه کنید.

6- لوله ها را برای تمام شب در یخچال قرار داده و سپس بگذارید 2 ساعت در دمای اتاق بماند.

7- نتیج را خوانده و ضبط کنید.

 

روش 7 : تست ویدال

(روش تست لوله ای H)

1- 8 لوله آزمایش را در یک رک بچینید.

2- به اولین لوله ml 9/0 از محلول سالین- فنل 25/0 درصد اضافه کنید. به 7 لوله باقی مانده ml5/0 محلول سالین- فنل اضافه نمایید.

3- ml 1/0 سروم بیمار را به لوله 1 اضافه کرده مخلوط نموده و ml 5/0 از آن را به لوله 2 منتقل کنید. این کار را برای هر لوله تکرار کنید. بالاخره ml 5/0 از محلول داخل لوله 7 را دور بریزید. رقت های نهایی 1:20 تا 1:1280 می باشند. لوله 8 به عنوان کنترل استفاده می شود. (توجه: همراه سروم های مورد آزمایش، یک سروم کنترل مثبت نیز باید آزمایش شود. برای این منظور باید از آنتی سروم پلی والان اختصاصی و غیر اختصاصی H استفاده کرد)

4- ml 5/0 از سوسپانسیون آنتی ژن مربوط را به تمام لوله ها اضافه کنید و با تکان دادن رک (ها) آنها را مخلوط کنید.

5- 2 ساعت در c 50 انکوبه کنید.

6- نتایج را خوانده و ضبط کنید.

شیگلا

روش 1: تست آگلوتیناسیون اسلايدی

روش کار دقیقاً مثل روشی است که قبلاً برای سالمونلا شرح داده شد.

روش 2: تست آگلوتیناسیون لوله ای

تهیه سوسپانسیون آنتی ژن

1- محیط infusion broth که قبلا برای تمام شب انکوبه شده را برداشته و 3 قطره فرمالین 40% به آن اضافه کنید. کدورت آبگوشت را با کدورت لوله شماره 1 براون میزان کنید. ( 750 میلیون باکتری در هر میلی لیتر) . یا

2- مقداری از کلنیهای رشد یافته در infusion agar را با لوپ برداشته و در محلول سالین- فرمل 5/0 درصد مخلوط کنید. کدورت را به صورتی که در بالا شرح داده شد میزان کنید.

طرز آزمایش

1- با شروع از رقت 1:10 آنتی سروم را به طور سریال در مقادیر ml 5/0 دوبرابر رقیق سازید.

2- ml 5/0 آنتی ژن به هر لوله و کنترل سالین اضافه کنید.

3- لوله ها را به مدت 4 ساعت در حمام آب c50 انکوبه کنید.

4- نتایج را خوانده و ضبط کنید.

اشریشیا

روش 1: قسمت آگلوتیناسیون اسلایدی

روش این آزمایش دقیقاً مشابه روشی است که قبلاً برای سالمونلا شرح داده شد.

روش 2: تست آگلوتیناسیون لوله ای

تهیه سوسپانسیون حرارت دیده آنتی ژن o

1- باکتری را به محیط infusion broth تلقیح نموده و 4 تا 6 ساعت در c37 انکوبه کنید. کدورت محیط را با کدورت لوله شماره 1 براون میزان کنید. (750 میلیون باکتری در هر میلی لیتر) و آبگوشت را برای یک ساعت در حمام آب جوش حرارت داده و سپس خنک کرده و استفاده نمایید.

2- مقداری از کلنیهای محیط infusion agar را با لوپ برداشت نموده و در سالین معلق سازید. کدورت لوله را به ترتیب فوق میزان کرده و یک ساعت حرارت داده، سرد نموده و سپس استفاده نمایید.

تهیه سوسپانسیون آنتی ژنko به ترتیب بالا است ولی به جای حرارت دادن 3 قطره فرمالین 40% اضافه می کنیم.

طرز آزمایش

1- با شروع از رقت 1:5 آنتی سروم "ob" را به طور سریال تا حد اقل 1:640 رقیق نمایید (از کنترل سالین نیز استفاده کنید) . مقادیر ml 5/0 را استفاده کنید.

2- بعد از اضافه کردن ml5/0 آنتی ژن حرارت دیده ""o به آرامی لوله ها را تکان داده و 16 تا 18 ساعت در c50 انکوبه نمایید. (تست های OB، 2 ساعت در c 37 انکوبه شده و سپس برای تمام شب در یخچال انکوبه می گردند).

3- نتایج را خوانده و ضبط کنید.