مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

آزمون الایزا ELISA

مقدمه

ELISA مخفف عبارت Enzyme-Linked Immunosorbent Assay یک روش آزمایشگاهی بیوشیمیایی ساده با حساسیت بسیار بالا است که امکان آنالیز تعداد زیادی نمونه را به صورت همزمان فراهم می کند. این روش در ایمونولوژی (ایمنی شناسی) برای تشخیص وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه مورد آزمایش استفاده می شود که عموما به عنوان ابزاری تشخیصی در پزشکی و پاتولوژی و همچنین تست کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع کاربرد دارد.

ELISA بر پایه اندازه گیری کمپلکس رنگی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی استوار است. به این ترتیب که نمونه مورد آزمایش با مقدار نامشخصی آنتی ژن روی فاز جامد (معمولا پلیت پلی استیرن) ریخته می شود، سپس آنتی بادی بازیابی اضافه می‌شود تا با آنتی ژن واکنش داده و ترکیبی ایجاد کند. آنتی بادی بازیابی با آنزیم پیوندی کووالانسی برقرار می کند. بین هر مرحله پلیت با محلول پاک کننده ملایمی شسته می شود تا هر پروتئین یا آنتی بادی باقیمانده شسته شود. پیش از آخرین مرحله شستشو، پلیت با اضافه کردن زیر لایه آنزیمی کشت داده می شود و ماده رنگی تولید می‌شود. طول موج رنگ به دست آمده توسط یک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌شود که این طول موج معرف حضور یک آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن و نیز غلظت آن است. در ELISA های قدیمی تر زیرلایه رنگ‌زا به کار گرفته می‌شد در حالیکه در تست های جدیدتر زیرلایه های فلوروژنیک با حساسیت بسیار بالاتر مورد استفاده قرار می گیرد.

امروزه ELISA یکی از قدرتمند ترین روش های آزمایشگاهی برای پی بردن به اختلالات سیستم ایمنی است، این تست به منظور پی بردن به آنتی‌ژن ناشی از ارگانی عفونی در بدن یا مواد غیر نرمالی که معرف برخی بیماری‌ها است انجام می شود. همچنین آنتی بادی‌هایی که در پاسخ به برخی عفونت‌ها یا بیماری‌ها به‌وجود آمده نیز توسط این تست قابل تشخیص هستند. تست ELISA اولین آزمایش متداول در غربال‌زنی HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقیق شده و به صفحه ای که حاوی آنتی‌ژن HIV است اضافه می‌شود. اگر آنتی بادی HIV در سرم وجود داشته باشد، به این آنتی‌ژن های HIV می چسبد. سپس به منظور از بین بردن دیگر اجزا سرم، پلیت شستشو داده می شود. یک "آنتی بادی ثانویه" ساخته شده مخصوص (یک آنتی بادی چسبیده به آنتی بادی دیگری) به پلیت اعمال شده و شستشوی دیگری انجام می‌شود. این آنتی بادی ثانویه به صورت شیمیایی به آنزیم از پیش تهیه شده می‌چسبد. این‌بار زیر لایه ای برای آنزیم اعمال شده و توسط آنزیم کاتالیز می‌شود که منجر به تغییر رنگ در فلورسانس می شود.

نتایج ELISA به صورت عددی گزارش می‌شود. بحث‌انگیزترین وجه این تست تعیین نقطه برش بین نتایج مثبت و منفی است.

علاوه بر آزمایش HIV از ELISA برای آزمایش بیماری‌هایی چون هپاتیت، تب استخوان‌شکن، leptospirosis ، عفونت انگلی، تبخال، سرخجه و دیگر عفونت‌های ویروسی و باکتریایی استفاده می‌شود.

پیش از پیدایش روش ELISA ، تنها گزینه برای انجام سنجش ایمنی، ایمنی سنجی رادیویی بود، که از آنتی ژن ها و آنتی بادی هایی که به صورت رادیواکتیو ممیز شده بودند استفاده می‌شد. در این روش در صورت وجود آنتی بادی یا آنتی‌ژنی خاص، رادیواکتیویته سیگنالی تولید می‌کرد. تئوری روش ایمنی سنجی رادیویی اولین بار سال 1960 توسط Rosalyn Sussman Yalow و Solomon Berson مطرح شد. از آنجایی‌که رادیواکتیویته خطرات زیستی داشت، پیشنهاد امن تر و ایمن تری مبنی بر جایگزینی سیگنال های غیر رادیو اکتیو به جای سیگنال های رادیو اکتیو ارائه شد. وقتی یک آنزیم مشخص (مانند پر اکسیداز) با زیر لایه مناسب واکنش می دهد، منجر به تغییر رنگ آن می‌شود که می تواند به عنوان سیگنال استفاده شود. البته باید تناسب بین سیگنال و وجود آنتی‌بادی یا آنتی ژن تعیین می‌شد که این پروسه توسط Stratis Avrameas و G.B. Pierce انجام شد. در سال 1966 توسط Wide و Porath این روش تکمیل تر شد. و در سال 1971 Peter Perlmann و Eva Engvall نهایتا به روش ELISA به شیوه امروزی دست پیدا کردند. ELISA امروزی مزایای زیادی نسبت به روش‌های ایمنی سنجی رادیویی دارند. از جمله عدم وجود خطر تشعشع، امکان اتوماسیون، امکان افزایش حساسیت روش، عمر طولانی کیت های آنزیمی، سرعت خوانش بالا و قیمت ارزان‌تر دستگاه‌ها و معرف ها.

ست الایزا را در حالت معمول برای ردیابی آنتی ژن یا آنتی بادی بكار می برند بدین ترتیب كه یكی از این دو ماده در بستر جامد ثابت می شود و برای ردیابی دومی بكار گرفته می شود، اما اساسا برای ردیابی هر جفت ماده ای كه مثل جفت آنتی ژن و آنتی بادی به هم گرایش داشته و قدرت اتصال مناسبی نسبت به هم دارند میتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتین به لیگاند مربوطه اش یا مولكول به گیرنده اختصاصی اش) البته این پدیده یعنی اتصال بین دو ماده ای كه آنتی بادی و آنتی ژن نیستند اما گرایش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرین است و برای بالا بردن حساسیت و اختصاصیت اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن در الایزا باید این اتصالات ناخواسته را به طریقی مهار كرده و یا كارهای جبرانی لازم را در نظر گرفت.

 

اساس متد الایزا چیست

اساس متد الایزا بر پایه انتی بادی استوار است در این متد با استفاده از خواص منحصر به فرد انتی بادی شامل قدرت اتصال بالای ان به انتی ژن ( Affinity) و شناسایی دقیق و صحیح
انتی ژن ُSpecificity) بهره گرفته می شود تا بیومولکولهای مورد جستجو شناسایی و اندازه گرفته شوند.در این متد جهت ایجاد سیگنال از انزیم ها و سوبستراهایی که تولید رنگ نمایند استفاده می شود . سپس رنگ ایجاد شده توسط دستگاه مربوطه جذب ان قرائت می گردد.

 

اصطلاحات

پيش از آغاز اين فصل علامت‌هاي اختصاري رايج را كه بطور گسترده مورد استفاده قرار خواهيم داد مرور مي‌نمائيم.

آنتي‌ژن = Ag

آنتي‌بادي = Ab

آنتي‌بادي اوليه = Ab1

آنتي‌بادي ثانويه = Ab2

آنزيم = E

آنزيم متصل شده به آنتي‌بادي = آنتي‌بادي متصل شده به آنزيم = *E = *Ab

آنتي‌بادي عليه آنتي‌بادي ديگر = Anti – Ab

سوبستراي آنزيم = S

سنجش رنگ بدست آمده با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر = Read

فاز جامد = I

 

انواع روشهاي الايزا

امروزه بر حسب اينكه :

الف) ماهيت آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي مورد سنجش چگونه است و چه هدف كلي از انجام تست الايزا داريم؟

ب) چه مواد و چه واكنشگرهايي در اختيار داريم و يا قادريم تهيه كنيم؟

روشهاي مختلفي از آزمونهاي الايزا طراحي شده و بوفور در كيت‌هاي تشخيص پاتوژنها و در آزمايشهاي تحقيقاتي مورد استفاده قرار مي‌گيرند. اين روشها در زير مورد بررسي قرار مي‌گيرند: (پليت ، كونژوگة مناسب و مادة رنگي مطلوب به سهولت توسط شركت‌هاي تجاري فراهم است.

1- الايزاي مستقيم

الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوشش‌دهي آنتي‌ژن:

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌ژن بر روي پليت‌ها

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر

 

توضيح:

در اين نوع الايزا، آنتي‌ژني كه به ته پليت متصل مي‌شود مستقيما با كونژوگه وارد واكنش مي‌شود. اين نوع روش الايزا، فقط در موارد مشخص استفاده مي‌ شود و آن موردي است كه مي‌ خواهيم بدانيم كه كونژوگه ما براي انجام واكنش مناسب هست يا خير. يعني در اينجا آنتي‌ ژن معمولا IgG مي‌باشد. بنابراين راه اصلي سنجش واكنش يا عدم واكنش كونژوگه‌اي كه عليه يك آنتي‌بادي تهيه شده است ، اين روش مي‌باشد.

تيتر كونژوگه را نيز مي‌توان با استفاده از اين روش الايزا سنجيد. امروزه براي سنجيدن واكنش مونوكلونال آنتي‌بادي كونژوگه شده با يك آنزيم كه برعليه يك آنتي‌ژن خاص مي‌باشد از اين روش استفاده مي‌كنند.

 

الايزاي مستقيم براساس جذب يا پوشش‌دهي آنتي‌بادي:

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي بادی بر روي پليت‌ها

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي اتصال يافته با آنزيم) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة ششم: قرائت پليت با الايزاريدر

توضيح:

اين نوع روش الايزا نيز فقط در موارد مشخصي استفاده مي‌شود. كلا آنتي‌ژن در موارد بسيار معدودي كونژوگه مي‌شود و استفاده از اين روش بستگي به نوع كار تحقيقاتي دارد.

 

2- الايزاي غير مستقيم

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌ژن

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن آنتي‌بادي (عليه آنتي‌ژن پوشش داده شده) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن كونژوگه (آنتي‌بادي ثانوية همراه با آنزيم عليه آنتي‌بادي اوليه) و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة ششم: شستشو

مرحلة هفتم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة هشتم: قرائت پليت با الايزاريدر

توضيج:

اين روش بسيار رايج مي‌باشد و معمولا براي مشخص نمودن آنتي‌بادي عليه يك پاتوژن خاص يا عليه يك مادة خاص درون سرم از اين روش استفاده مي‌شود. "ويژگي" اندازه‌گيري بستگي به خلوص آنتي‌ژني متصل شده به پليت دارد. در اين روش سرم ما مي‌تواند حاوي آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن باشد (مثلا در افراد مبتلا به بيماري كه بدنشان عليه پروتئين‌هاي آنتی ژنی يک پاتوژن آنتي‌بادي ساخته است) و مي‌تواند آنتي‌بادي عليه آن آنتي‌ژن نداشته باشد (افراد سالم). در اين روش در مراحل اوليه و تنظيم تست الايزا، مي‌توان سرم را با رقت‌هاي مختلف اضافه كرد (سرم را مي‌توانيم با محلول رقيق كنندة سرم رقيق كنيم) و بهترين رقت را در تست‌هاي الايزاي موازي كه فقط رقت سرم آنها متفاوت است بدست آورد. اين روش در كيت‌هاي تجاري تشخيص بيماريها بوفور استفاده مي‌شود. با استفاده از اين روش تيتراسيون كونژوگه نيز انجام مي‌شود.

 

3- الايزاي ساندويچ

الف) ساندويچ مستقيم

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌بادي

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن آنتي‌ژن و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن آنتي‌بادي كونژوگه شده با آنزيم و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة ششم: افزودن سيستم رنگي

مرحلة هفتم: قرائت پليت توسط الايزاريدر

 

توضيح:

دو آنتي‌بادي كه در اين سيستم بكار مي‌روند مي‌توانند هر دو از يك گونه باشند و يا مي‌توانند از گونه‌هاي متفاوتي از موجودات بدست آيند. گاهي اوقات به آنتي‌ژني كه در اين سيستم بكار مي‌رود آنتي‌ژن تسخير شده يا به دام افتاده مي‌گويند. در اين روش استفاده از محلولهاي بلوكه كننده يا افزودن محلولهاي بلوكه كننده به محلول پوشش‌دهي و محلولهاي شستشو بسيار مهم است.

نكتة مهم در اين روش آنست كه بايد بدانيم كه آنتي‌ژن ما حداقل دو محل اتصال به آنتي‌بادي داشته باشد تا بتواند به اين آنتي‌بادي‌ها متصل شود.

در روش الايزاي ساندويچي مولكول اندازه گيري شده در واقع در بين دو مولكول مختلف آنتي بادي قرار ميگيرد (ساندويچ ميشود) مثلا اين روش را در مورد اندازه گيري سايتوكاين اينترفرون گاما شرح ميدهيم:

اساس) سلول های طحالي گرفته شده از موش های دريافت کننده واکسن در اثر تحريک با آنتي ژن اختصاصي در محيط کشت تکثير پيدا خواهند کرد برای تعيين اينکه غالب سلول های تکثير يابنده از نوع Th1 هستند يا Th2 بايد پروفيل سيتوکيني در محيط کشت مشخص شود بدين منظور تعيين مقدار سيتوکين های IL-4 و IFN-g ترشح شده توسط سلول ها در محيط کشت مد نظر قرار ميگيرد.

چنانكه در شكل زير مشخص شده است در اين روش آنتي بادی منوکلونال ضد آنتي ژن به کف plate چسبانده ميشود سپس فرصت داده ميشود تا آنتي ژن (در اين تحقيق سيتوکين IL-4 و IFN-g ) به آن متصل شود در مرحله بعدی آنتي بادی پلي کلونال ضد آنتي ژن اضافه ميشود که متصل به آنزيم پراكسيداز HRP است و اضافه شدن سوبسترا همراه با کروموژن منجر به ايجاد محصول رنگي ميشود که توسط دستگاه ELISA Reader قرائت ميگردد چون در اين روش آنتي ژن در بين دو آنتي بادی قرار ميگيرد لذا به ساندويچ مشهور شده است. تصوير زير گوياي اين شباهت است.

 

ب)ساندويچ غير مستقيم

مرحلة اول: پوشش‌دهي آنتي‌بادي

مرحلة دوم: شستشو

مرحلة سوم: افزودن آنتي‌ژن و گذراندن زمان انكوباسيون

مرحلة چهارم: شستشو

مرحلة پنجم: افزودن آنتي‌بادي عليه آنتي‌ژن

مرحلة ششم: شستشو

مرحلة هفتم: افزودن آنتي‌بادي سوم كونژوگه شده با آنزيم (عليه آنتي‌بادي دوم)

مرحلة هشتم: شستشو

مرحلة نهم: قرائت پليت توسط الايزاريدر

 

توضيح:

مشخص است كه آنتي‌بادي دوم بايد از يك گونة متفاوت از موجودات تهيه شود.

 

4- الايزاي رقابتي يا مهاري

در روشهاي رقابتي اساس سنجش بر رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي ( كه يكي از آن دو نشاندار است) براي اتصال به ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر هر دو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري يا بالكينگ مي نامند. در روش مهاري ممكن است در بين 2 مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدي شستشو انجام شود يا انجام نشود مثال بارز روشهاي رقابتي و مهارتي سنجش T3,T4 مي باشد. انواع روشهاي رقابتي عبارتند از:

 

الف) روش رقابتي يا مهاري براي انتي ژن:

اساس اين روش بر رقابت بين آنتي ژن نشاندار و آنتي ژن موجود در نمونه براي اتصال به يك آنتي بادي اختصاصي كوت شده در چاهك استوار است. در اين روش مقدار آنتي بادي كوت شده بايد محدود باشد و ملكول سيگنال دهنده همان آنتي ژن نشاندار است, اساس RIA و EIA كلاسيك به همين روش استوار است

در اين روش منحني پاسخ- دوز به صورت معكوس خواهد بود, بدين معني كه آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادي از آناليت غير نشاتندار موجود در نمونه به مقدار كمتري به آنتي بادي متصل مي شود و در نتيجه سيگنال هم بوجود خوههد آمد.

محدوده تعيين آناليت با اين روش ممكن است بوسيله استفاده از مولكول نشاندار با فعاليت اختصاصي زياد تقويت شود اما حداقل مقدار قابل تشخيص (كمترين مقدار از آناليت كه قابل تشخيص خواهد بود) توسط تمايل ؟آنتي بادي مورد استفاده تعيين مي شود, با اين وجود غلظتهاي خيلي كم از هاپتن ها عموما توسط همين روش قابل تعيين اند و حساس ترين روشي است كه مي تواند مقدار كمتر fmol را هم تشخيص دهد.

در برخي از موارد نشاندار كردن روي خصوصيات هاپتن اثر مي گذارد در نتيجه در روش رقابتي براي تعيين آنتي ژن از يك آنتي بادي نشاندار استفاد مي شود, در اين نوع از سنجش ها اين مطلب ضروري است كه فاز جامد توسط آنتي ژن با مقدار كم و ثابت پوشيده مي شود, در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت كوت شده در چاهك براي اتصال به آنتي بادي نشاندار رقابت مي كند. در اينجا هم منحني استاندار معكوش است, از اين روش بيشتر براي سنجش به روش كمي لومينسانس استفاده مي شود.

 

ب)روش رقابتي براي آنتي بادي:

دراين روش بين دو آنتي بادي يكي در نمونه به صورت غير نشاندار و يكي به صورت نشاندار شده با آنزيم برا اتصال به يكي آنتي ژن ك.ت شده در چاهك صورت مي پذيرد, بديهي است كه هر چه مقدار آنتي بادي نمونه بيشتر باشد انتب بادي نشاندار كمتري به چاهكها متصل شده و سيگنال نيز كمتر خواهد بود و در نتيجه منحني استاندار نيز معكوس مي باشد و در نتيجه منحني استاندار نيز معكوش مي باشد, شاخص ترين مثال اين روش اندازه گيري آنتب باد بر ضد HBc (HBc Ab) است.

تست اليزا برای جستجوی آنتي ژن:

ELISA روش بسيار حساسي است که (معمولا) برای جستجوی آنتي ژن يا آنتي بادی بکار ميرود در تحت شرايط تنظيم شده (از نظر غلظت يوني و pH) پروتئين ها (آنتي ژن يا آنتي بادي) به طور خودبخود تمايل دارند که به بستر جامد (در اين تست plate هايی از جنس پلي استيرن) متصل شوند، ماهيت اين اتصال بخوبي معلوم نشده است اما برگشت پذير بوده و با استفاده از pH هاي بالاتر يا پايين تر و استفاده از غلظت هاي يوني بالا اتصال قطع ميشود اين نوع اتصال خودبخودي اگر چه ظرفيت محدودی دارد ولي با بكارگيري سيستم های تقويتي مناسبي مثل سيستم آنزيم-سوبسترا اين اتصالات وسيله بسيار خوبي برای طراحي سيستم الايزا گرديده است.

براي انجام الايزا:

1 ) ابتدا بايد پروتئين مورد نظر را به كف پليت چسباند.

2 ) نقاط اتصال باقي مانده را بايد با محلول پروتئيني مناسب مسدود كرد.

3 ) محلول مورد آزمايش را اضافه كرد تا دو ماده همديگر را پيدا كرده و متصل شوند

4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه را براي افزايش حساسيت آزمايش بكار گرفت

5 ) سيستم آنزيمي نهايي را به راه انداخته و رنگ نهايي توليد شده را اندازه گرفت

 

حال اين 5 مرحله به تفكيك توضيح داده مي شوند:

1 ) اتصال پروتئين به كف پليت (Coating):

آنتي ژن (يا آنتي بادی) در مقاديری در حدود ميکروگرم به داخل چاهک پليت الايزا اضافه شده و فرصت داده ميشود تا به مقدار کافي به کف چاهك (well) متصل شود براي اينكار بسته به نوع پروتئين بافرهاي مختلفي به كار گرفته مي شود و غلظت پروتئين نيز بايد مناسب سازي شود در مقادير بسيار پايين حساسيت رديابي پايين مي آيد و در مقادير بالاي آنتي ژن اتصالات سستي نيز برقرار ميشود كه در مراحل بعدي كنده شده و هنگام شستشو آنتي ژن همراه با آنتي بادي اختصاصي دفع مي شوند و لذا حساسيت تست مجددا پايين مي آيد.

بطور كلي اين مرحله اساسي بوده و نقش زيادي در نتيجه نهايي دارد ايده آل هاي مورد انتظار براي اين مرحله اينها هستند:

الف) مقدار آنتي ژن متصل شده به كف همه چاهك هاي يك پليت بايد يكنواخت باشند و كمترين واريانس را در نتيجه ايجاد كنند، بدين معني كه وقتي يك نمونه واحد را در چند چاهك مختلف منتقل نموده و آزمايش كنيم بايد نتايج بدست آمده به هم نزديك بوده و حداقل خطا را نشان دهند. همچنين اگر آزمايش مورد نظر در حجم بالا انجام ميگيرد و چند پليت را هم زمان كوت نموده و استفاده ميكنيم بايد جنس پليت ها و شركت تهيه كننده آنها يكسان باشد تا از خطاي مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پليت ها جلوگيري شود و ترجيحا بافر كوتينگ و زمان كوتينگ و محلول آنتي ژني آماده شده براي كوتينگ بهتر است يكسان باشند.

ب) اتصالات برقرار شده بين آنتي ژن و بستر جامد بايد به اندازه كافي محكم و قوي باشند تا در مراحل شستشوي بعدي كنده نشوند، معمولا براي آنتي ژن هاي عادي، اتصال دهنده اضافي لازم نيست ولي اگر آنتي ژني استثنائاً با روش معمول به كف پليت نچسبيد يا اتصالات سستي برقرار كرد از مواد و روش هاي خاصي براي اتصال آنتي ژن به كف بستر استفاده مي شود (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئيد يا اشعه ايكس يا ...).

ج) پروتئين متصل شده نبايد آنقدر كم باشد كه نتواند مقادير بالاي آنتي بادي را جذب كند در اين صورت غلظت هاي بالاي آنتي بادي قابل تشخيص نخواهد بود از طرفي پروتئين متصل شده نبايد آنقدر زياد باشد كه اتصالات غيراختصاصي از اتصالات اختصاصي بيشتر شوند كه در اين صورت جواب آزمايش قابل اغتماد نخواهد بود

براي تامين اين سه هدف تمهيدات خاصي به كار گرفته مي شوند كه در فرصتي مناسب توضيح داده خواهند شد

 

2 ) مرحله مسدود سازي يا بلوكينگ (blocking):

نقاطي از كف پليت كه با پروتئين اختصاصي پوشانده نشده اند با استفاده از محلول هاي پروتئيني خنثي (از اين نظر كه در واكنش اختصاصي بعدي اثر سوئي ندارد) پوشانده مي شوند محلول هاي پروتئيني براي اين منظور حاوي شير کم چربي يا آلبومين گاوی يا ژلاتين و يا کازئين ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت هاي غير يوني خاصي نظير Tween 20 يا Tween 80 يا ... نيز به عنوان كمكي استفاده مي شوند نوع اين مواد و مقادير بكار برده شده به صورت تجربي تعيين مي شوند و با توجه به تجربيات ديگران مي توان محدوده خاصي را براي كار مورد نظر امتحان كرد و بهترين غلظت را بدست آورد (چون پروتئين ها از ريشه هاي جانبي متفاوتي برخوردارند لذا براي پروتئين هاي بسيار خالص مثل پروتئين هاي ريكامبينانت مناسب سازي اين تركيبات در بالا بردن اعتبار نتايج بسيار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يوني بافر بلوك كننده نيز اهميت زيادي دارد و براي اتصال انتخابي پروتئين مورد نظر (از ميان مخلوط پروتئيني) ميتوان بافرهاي مختلف و غلظت يوني متفاوت را ارزيابي كرده و بهترين بافر را براي آزمايش مورد نظر بدست آورد.

 

 

3 ) اتصال آنتي ژن و آنتي بادي

محلول مورد آزمايش كه احتمال ميرود حاوي مقادير قابل رديابي از آنتي بادي بر عليه آنتي ژن اختصاصي موجود در كف پليت ميباشد در اين مرحله در بافر مناسبي تهيه شده و اضافه مي شود آنتي بادي شناور در محلول، آنتي ژن متصل به بستر را پيدا كرده و به آن متصل مي شود بندرت اين آنتي بادي متصل به آنزيم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزيمدار در مرحله بعدي بكار گرفته مي شود.

آنتي بادي هاي متصل نشده با عمل شستشو از محيط حذف مي شوند بافر شستشو معمولا داراي پروتئين خنثي به كار گرفته شده در محلول بلوكان است. چرا؟ حاوي دترژانت ميباشد. چرا؟ و از نظر قدرت و pH بافري مناسب براي اتصال آنتي ژن با آنتي بادي است. آنتي بادي ها، سرم ، و محلولهاي بكار گرفته شده در مراحل مختلف الايزا معمولا در بافر شستشو رقيق مي شوند.

 

 

 

4 ) سيستم هاي تقويتي اوليه

سيستم تقويتي اوليه قبل از سيستم تقويتي اصلي (كه همانا بكار گرفتن خصوصيت آنزيمهاست) ميباشد در اين مرحله ما واكنش هاي اضافه تري را به كار ميگيريم تا قدرت اندازه گيري تست (حساسيت و اختصاصيت) بالا برده شود.

بدين منظور از قدرت تقويت كنندگي بيوتين-آويدين، بيوتين-استرپتاويدين، لكتين-ليگاند و ... استفاده مي شود.

 

5 ) تقويت آنزيمي

هر آنزيمي بر روي سوبستراي اختصاصي خود اثر كرده و آنرا به محصول تبديل مي كند اين واكنش در طي زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهي از محصول در محيط مي شود بدين معني كه با گذشت زمان معيني يك مولكول آنزيم مي تواند مولكول هاي سوبستراي بسياري را به محصول تبديل كند اين اثر افزايشي در حقيقت اساس الايزا را تشكيل ميدهد. بدين ترتيب كه آنتي بادي نهايي باقي مانده پس از شستشوي نهايي با مولكول آنزيم متصل است و افزودن سوبسترا در طي زمان معيني (مثلاً يك ساعت) منجر به آزاد سازي مقادير متنابهي سوبسترا مي گردد كه يا خود رنگي ميباشد يا در واكنش با ماده ديگري (كروموژن يا رنگزا) كه به محيط اضافه شده است رنگ توليد ميكند در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصي خوانده شده و محاسبات لازم بر روي داده هاي بدست آمده انجام مي گيرد.

 

در شكل بالا پروتئين rgp63 به كف چاهك متصل شده است (مرحله 1)، بعد از مسدودسازي نقاط باقي مانده (مرحله 2) محلول مجهول اضافه شده است و آنتي بادي اختصاصي شناسايي كننده آنتي ژن (موجود در محلول) به آنتي ژن متصل شده و بقيه محلول با عمل شستشو از محيط حذف شده است (مرحله 3). سپس آنتي بادي ضد آنتي بادي اول كه با آنزيم گونژوگه شده اضافه شده است (مرحله 4). پس از شستشو و حذف مولكول هاي آنزيم دار متصل نشده سوبسترا و كروموژن اضافه شده است در اثر آنزيم باقي مانده در چاهك ماده آبي رنگ حاصل شده است ميتوان آن را قرائت كرد در مورد برخي سوبستراها با افزودن محلول هاي ديگري رنگ ايجاد شده را هم تقويت نموده و هم تثبيت ميكنند تا نتايج بهتري اخذ شوند (مرحله 5).

 

شرح مراحل انجام یک آزمون الایزا

براي انجام تست ELISA بايد نمونه خون از بيمار گرفته شود و سرم آن جدا شود. براي اين كار بايد به مواردي دقت داشت. مثلا از بستن گارو براي مدتي طولاني بايد اجتناب كرد چرا كه ممكن است در پارامترهاي مورد اندازه گيري تاثير گذاشته و موجب بروز خطا شود. در هنگام جداسازي سرم نيز بايد دقت شود كه فيبرينوژن يا ذرات ديگر نباشد. پيش از انجام آزمايش بايد به كيفيت كيت هاي مورد مصرف توجه كرد، همچنين نگهداري آن‌ها بايد در دماي­C 8-2 صورت گيرد. تمامي محلول‌هاي موجود در كيت قبل از مصرف بايدخوب مخلوط شده و به دماي آزمايشگاه برسد و پس از استفاده به منظور افزايش پايداري، بلافاصله اجزاء كيت به يخچال منتقل شود. درحين انجام آزمايش بايد از نوسانات غير تدريجي دما در هنگام انكوباسيون، مانند باز بودن پنجره يا درب آزمايشگاه در محل آزمايش جلوگيري كرد. ايجاد پديده هوك باعث ايجاد نتايج پايين كاذب مي‌شود لذا توصيه مي‌شود براي جلوگيري از اين پديده سرم رقيق نشده و سرم يك دهم رقيق شده، مخلوط وآزمايش را انجام دهيم، تا اثر احتمالي هوك اصلاح شود. از آنجا كه فريز و ديفريز كردن نمونه ها باعث كاهش سطح برخي از هورمون ها مي‌شود، بايد تا حد ممكن از اين كار پرهيز شود. پيش از اندازه گيري بايد كليه ابزارهاي مورد استفاده اعم از نوك ابزار نمونه‌گيري و كيت ها استريل شوند. كه البته استفاده از ابزارهاي يكبار مصرف پيشنهاد مي‌شود و بايد قبل از استفاده لوله آزمايش هاي شيشه‌اي آن‌ها را با اسيد سولفوريك رقيق شستشو داده و با آب مقطري كه دوبار تقطير شده آبكشي انجام داد. از به كار بردن محلول‌هاي شستشوي نامناسب يا آب مقطر ناخالص بايد پرهيز كرد. ضمنا بايد از كاركرد صحيح دستگاه‌ها و تجهيزات مورد استفاده به عنوان مثال از صحت طول موج فيلترهاي خواننده ELISA به كمك استفاده از ماده رنگي با ثبات، نظير بيكرومات پتاسيم يا عملكردصحيح دستگاه واشر ELISA اطمينان حاصل كرد.

1- فاز جامد

امروزه بیشتر از پلیت‌های 96 خانه‌ای بعنوان فاز جامد استفاده می‌شود. انواع انعطاف‌پذیر و جداشدنی از پلی‌وینیل كراید و انواع سخت و محكم از پلی‌استیرن ساخته می‌شوند. هم ‌اكنون شركت‌های معتبر و متعددی به‌ساخت انواع مختلف پلیت‌های الایزا مشغول هستند دربعضی از انواع این پلیت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می‌باشند.

بعضی از پلیت‌ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می‌باشند. امروزه آزمایشهای متعددی با موفقیت با هر كدام از این نوع پلیت‌ها انجام می‌شود و نمی‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت‌ها دارد. می‌توان با انجام دو آزمایش الایزای كاملا یكسان كه تنها در نوع پلیت متفاوتند و بررسی نتایج تشخیص داد كه برای كدام نوع از آنتی‌ژن، كدام پلیت بهتر است. بطور كلی پلیت‌هایی كه انتهای چاهك‌های آنها تخت می‌باشد توصیه می‌شود.

 

2- پوشش‌دهی

این مرحله كه یكی از مهمترین مراحل آزمون الایزا می‌باشد عبارتست از اتصال پروتئین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر روی پلیت ,درون چاهك‌ های یك پلیت 96 خانه‌ای, كه عمدتا براساس واكنش‌ های آبگریز مابین ماتریكس پلاستیكی و پروتئین می‌باشد. بنابراین هر پروتئین یك ثابت اتصال متفاوتی با پلیت‌ها دارد. این واكنش بستگی به بار خالص پروتئین ندارد.

بنابراین افزودن هیدروفوبیسیتة واكنش پروتئین – پلیت موجب بروز این نواحی هیدروفوب در پروتئین‌ها شده و واكنش مابین پلیت و پروتئین را مستحكم‌ تر می‌ نماید، این دناتوره نمودن جزیی پروتئین‌ها توسط قراردادن پروتئین در معرض دترژنت‌های ملایم و مواد دارای pH پائین حاصل می‌شود كه بعد از این مجاورت می‌توان با استفاده از یك روش دیالیز مناسب، بافر پوشش‌دهی را با این مواد دناتوره كننده تعویض نمود.

 

عمل پوشش‌دهی به عوامل زیر بستگی دارد.

الف) مدت زمان پوشش‌دهی

ب) دما

ج) غلظت پروتئین‌هایی كه باید پوشش داده شوند.

د)‌ نسبت سطح چاهك‌ها به حجم محلول پوشش دهی

هـ) ضریب انتشار مولكولهای پروتئینی درون محلول پوشش‌دهی درون چاهك‌ها

عوامل فوق یكپارچه بوده و جدای از یكدیگر نیستند. یكی از مهمترین موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئین برای اتصال مناسب به پلیت می‌باشد كه از طریق تیتراسیون پروتئین بدست می‌آید.

محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl یك راهنمایی خوبی برای بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئین‌ها جهت اتصال خوب به پلیت می‌باشد البته این محدوده وابستگی به خلوص نسبی پروتئین موردنظر جهت پوشش‌دهی دارد بنابراین غلظت یك پروتئین جهت پوشش‌دهی وابسته به فعالیت آن پروتئین می‌باشد مشخص است كه یك محلول پروتئینی كه دارای مقدار كمی از پروتئین موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئین به پلیت برطبق نسبت حضور آن پروتئین در محلول كم می‌باشد و ناخالصی‌های موجود در محلول پروتئینی سطوحی را كه باید پروتئین موردنظر ما در اختیار داشته باشد اشغال می‌نمایند كه در نهایت منجر به یك اندازه‌گیری ضعیف می‌شود.

با استفاده از چند تست الایزا كه در آنها غلظت پروتئین موردنظر برای پوشش‌دهی متفاوت است می‌توان به یك غلظت مناسب از پروتئین جهت پوشش دادن دست یافت. توجه به این مطلب مهم است كه دانسیتة اتصال پروتئین به پلیت درنتیجة نهایی بسیار مهم است. اتصال با دانسیتة بالا حتی ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتایج ضعیف منجر شود چرا كه این دانسیتة بالا می‌تواند از لحاظ قضایی اجازة نزدیك شدن پروتئین دوم (آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی) را به پروتئین پوشش داده شده ندهد. درحقیقت مولكولهای پروتئین پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالایی (و بینابین یكدیگر) به سطح چاهك متصل شده‌اند كه حتی جایگاه‌های اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئین دوم (فرضا آنتی‌بادی) نمی‌باشد.

غلظت‌های بالای پروتئینی كه باید پوشش داده شود نیز منجر به‌همین مسئله می‌شود. رابطه غلظت یك آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی با چگالی نوری (OD) بدست آمده در مرحلة نهایی تست الایزا یك رابطة خطی صرف نمی‌باشد و برای هر پروتئینی بسته به فرم فضایی آن پروتئین و نیز در هر محدوده‌ای از غلظت‌های مختلف آن پروتئین متفاوت می‌باشد.

هیدروفوبیسیتة واكنش پروتئین – پلیت وابسته به دما نیز می‌باشد افزایش دما موجب افزایش این هیدروفوبیسته می‌شود و دانستیم كه این افزایش منجر به اتصال مستحكم‌ تر پروتئین به پلیت می‌ شود یكی از رایج‌ترین روش‌های پوشش‌دهی از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پلیت با پروتئین در دمای 37°c می‌ باشد كه در این دما بین 1 تا 3 ساعت زمان مناسبی برای اغلب پروتئین‌ ها می‌باشد در مرتبة بعد می‌توان روش پوشش‌دهی در طول شب در 4°c و یا تركیبی از ایندو را بكار گرفت.

بسته به ماهیت پروتئین‌ها، گاهی اوقات پوشش‌دهی در دمای آزمایشگاه با مدت زمان طولانی‌تر موردنظر قرار می‌گیرد.

البته مشخص است كه افزایش دما در مدت زمان طولانی ممكن است باعث تغییراتی در ساختار پروتئین موردنظر جهت اتصال به پلیت شود. تكان دادن یكنواخت، آرام و منظم پلیت نیز می‌تواند با افزایش میزان برخورد و درنتیجه اتصال پروتئین به پلیت، زمان موردنظر برای پوشش‌دهی را كاهش دهد.

 

3- بافر پوشش‌دهی

بیشترین بافرهایی كه هم‌اكنون مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50 میلی مولار،

Tris – Hcl بیست میلی مولار با pH = 8/5 و یا

PBS 10 میلی مولار با pH = 7/2

اغلب روش‌های الایزا از یكی از این سه نوع بافر استفاده می‌نمایند.

بافرهایی غیر از موارد فوق هنگامی مورد استفاده قرار می‌گیرند كه مشكلی در پوشش‌دهی با بافرهای فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوری بهترین بافری كه مورد استفاده قرار می‌ گیرد بافری است كه دارای pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئین اتصالی باشد. اما درعمل اندازه‌گیری این مطلب آسان نمی‌باشد چراكه پروتئین اتصالی (فرضا آنتی‌ژن) حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت می‌باشد. با انجام چند آزمایش الایزا كه pH‌های متفاوت و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش‌دهی داشته باشد می‌توانیم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئین به پلیت را بدست آوریم.

پروتئین‌ های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یك pH پائین‌ تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه مابین پروتئین و پلیت دارند و در آزمایشی جهت پوشش دادن پروتئین‌ های ویروس Herpes simplex كه خاصیت اسیدی دارند بهترین pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.

در روش‌ های رایج امروزی پوشش دادن با بافر PBS یا كربنات اغلب موفقیت‌آمیز است.

گاهی اوقات بعضی از آنتی‌ژن‌ها مشكلاتی را در پوشش‌دهی بوجود می‌آورند این آنتی‌ژن‌ها شامل پلی‌ساكاریدها لیپوپلی‌ساكاریدها و گلیكولیپیدها هستند كه پوشش‌دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می‌نمایند در اینگونه موارد یك پوشش‌دهی ابتدایی موردنیاز است كه با یك آنتی‌سرم اختصاصی انجام می‌شود كه یك حالت ساندویچی را بوجود می‌آورد كه در ادامة همین فصل توضیح داده خواهد شد.

بنابراین مخلوط تخلیص نشده آنتی‌ژن‌ها مناسب برای پوشش‌دهی مستقیم نمی‌باشد و درصورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده می‌شود.

بدلیل ماهیت غیر كووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جداشدن یك پروتئین از پلیت نیز ممكن است رخ دهد اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد این مطلب تأثیر مهمی در یك آزمون الایزا نخواهد گذاشت.