مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

پروتئاز

پروتئازها آنزیم‌هایی هستند که باعث تجزیه پروتئین‌ها می‌شوند. پروتئازها شامل سرین پروتئازها، متالوپروتئازها، آسپارتیک پروتئازها، سیستئین پروتئازها و ترئونین پروتئازها، می‌باشند. یک پروتئاز ممکن است چندین سوبسترا داشته باشد یا اینکه یک سوبسترا توسط چندین پروتئاز برش یابد. برخی از پروتئازها به علت اتولایزیز حتی می‌توانند خود، سوبسترای خود باشند. پروتئازها اغلب بصورت آبشاری عمل می‌کنند یعنی بطور پی در پی یک پروتئاز باعث فعال شدن پروتئاز بعد از خود می‌شود. نمونه بارز واکنش‌های آبشاری پروتئازی را می‌توان در اپوپتوز و پروتئازهای کاسپاز مشاهده کرد.

کارکردها

پروتئازها دارای اهمیت زیادی در کنترل فعالیت‌های سلولی دارند. در سلول‌های مختلف انواع زیادی از پروتئازها در هر زمان مشخص بیان می‌شوند. برای مثال: تعداد زیادی از پروتئین‌هایی که در سلول‌ها بیان می‌شوند به فرم غیر فعال هستند. برای اینکه این پروتئین‌ها فعال شوند باید توسط پروتئازها پردازش شوند. پردازش پروتئولایتیکی یکی از راه‌های کنترل فعالیت پروتئین‌ها است. بسیاری از پروتئین‌ها مانند آنزیم‌ها، سایتوکین‌ها، هورمون‌های رشد، رسپتورهای سلولی و...، به این روش فعال می‌شوند. در اثر این کنترل پروتئولایتیکی، فعالیت‌های مختلف سلولی مانند رونویسی و همانند سازی، پیشرفت سیکل سلولی، تکثیر سلول، تمایز، اپوپتوز و...، کنترل می‌شود. نقص در این سیستم پردازش پروتئولایتیکی همچنین می‌تواند منجر به بیماری‌هایی مانند سرطان، آرتریت، بیماری‌های نورودژنراتیو و بیماریهای قلبی عروقی شود.

دگرادوم

در سلول‌های مختلف تعداد زیادی پروتئاز در هر زمان مشخص و شرایط خاص بیان می‌شود. برای مثال در انسان تاکنون بیش از ۵۰۰ پروتئاز شناسایی شده‌است که بطور متوسط در هر سلول د رهر شرایط خاص حدود ۲۰۰ تا از آنها بیان می‌شوند. به کلیه پروتئازها و سوبستراهای آنها که در یک زمان مشخص و تحت یک شرایط خاص در یک سلول بیان می‌شوند، دگرادوم آن سلول گفته می‌شود.

بررسي توليد پروتئازهاي قليايي توسط باسيلوسها

بعد از آميلازها ،‌پروتئازها مهمترين آنزيم‏هاي صنعتي محسوب مي‏شوند و سالانه حدود 500 تن از اين آنزيمها بر مبناي پروتئين خالص توليد مي‏شود . در صنعت پروتئازها هم از باكتريها و هم از قارچها توليد مي‏شوند . مهمترين وجه تمايز آنزيم پروتئاز pH اپتيمم آن است و از اين لحاظ پروتئازهاي تجاري به سه گروه اسيدي ، خنثي و قليايي تقسيم‏بندي مي‏شوند . حداكثر فعاليت پروتئازهاي قليايي در pH : 9-11 بوده و محدوده وسيعي از پيوندهاي پپتيدي را مي‏شكنند .اين آنزيمها داراي كاربردهاي فراواني هستند و در صنايعي نظير صنايع شوينده و دترجنت ، چرم سازي و دباغي ؤ صنايع غذايي ، صنايع تخميري ، بيوترانسفروماسيون ، تصفيه پساب ،‌توليد مواد معطر و خوش طعم ،‌ صنايع رغن كشي ،‌صنايع الكل سازي و ..... مورد استفاده قرار مي‏گيرند . در اين تحقيق گونه‏هاي مختلف جنس باسيلوس از نقطه نظر توليد پروتئاز قليايي با يكديگر مورد مقايسه قرار گرفتند و مشخص شد كه دو گونه جداسازي شده از خاك منطقه اصفهان يعني باسيلوس پلي ميكسا و باسيلوس سرئوس بيشترن توليد را انجام مي‏دهند . پس از غربال‏گري ، اثر فاكتورهاي مختلف محيطي در توليد اين آنزيم توسط دو گونه مورد نظر ، بررسي شد . با توجه به اينكه تمام سنجش‏هاي آنزيمي انجام شده در اين تحقيق با استفاده از سوبستراي قليايي با 11 = pH انجام گرفت تنها پروتئاز قليايي در اين pH فعال است و نشان دهنده اين نوع آنزيم در محيط است م بهترين محيط كشت براي توليد پروتئاز قليايي توسط باسيلوس پلي ميكسا و با سيلوس سرئوس ، محيط شير بود و حداكثر فعاليت آنزيم در اين محيط براي اين دو گونه به ترتيب 5/580 (U/ml) و 5/535 (U/ml) در 11 = pH اندازه گيري شد . بررسي توليد در يك محيط صنعتي مانند ملاس چغندر نشان داد كه هر چه بريكس ملاس پائين تر باشد ،‌توليد بيشتر است و بيشترين توليد پروتئاز قليايي در بريكس 2 ملاس چغندر و حداكثر فعاليت آنزيم در آن ، 473 (U/ml) بود.

بررسي اثر كشت اوليه ، نشان داد كه هر چه كشت اوليه غنيتز از پروتئين باشد ، مقدار توليد آنزيم در فاز توليدي بيشتر خواهد شد . بهترين pH براي توليد پروتئاز قليايي براي هر دو گونه ، 7 و حداكثر فعاليت آنزيم در محيط گلوكز براي باسيلوس پلي ميكسا 358 (U/ml) و براي باسيلوس سرئوس ، 5/360 (U/ml) بود . بهترين دماي توليدي براي هر دو گونه 60 درجه سانتيگراد و بهترين سرعت هوادهي 200 r.p.m اندازه گيري شد . در مرحله بعدي اثر فاكتورهايي نظير حرارت ،‌ برودت وانجماد ، خشكي و ليوفيليزاسيون و يونهاي مختلف بر روي پايداري آنزيم پروتئاز قليايي حاصل از باسيلوس پلي ميكسا مورد ارزيابي قرار گرفت . اين آنزيم در 55 و 80 درجه سانتيگراد پس از 10 دقيقه به ترتيب 96% و 28% فعاليت اوليه خود را حفظ مي‏كند . برودت 4 درجه سانتيگراد و 20- درجه سانتيگراد پس از زمانهاي طولاني اثري در فعاليت آنزيم نمي‏گذارد . همچنين اين آنزيم نسبت به خشكي و ليوفيليزاسيون مقاوم بوده و پس از 2 ماه تقريباً 100% - 98% فعاليت اوليه خود را حفظ مي‏كند . يونهاي مختلف اثر زيادي در كاهش يا افزايش فعاليت آنزيم مذكور نمي‏گذارد و تنها HgCl2 در غلظتهاي 2000 – 200 (µg/ml) باعث 59% - 53% كاهش فعاليت مي‏گردد. مقايسه منحني رشد ميكروارگانيسم با توليد پروتئاز قليايي نشان داد كه ترشح آنزيم به محيط خارج در فاز مرگ و همزمان با فاز اسپورزايي ميكروارگانيسم به حداكثر مي‏رسد . همچنين استفاده از سولفات آمونيوم براي رسوب دادن آنزيم فوق باعث غير فعال شدن آن به طور قابل برگشت مي‏شود و استفاده از آ‘ مقطر براي رقيق كردن رسوب حاصله باعث برگشت فعاليت آنزيم مي‏گردد.

در نهايت تثبيت وايموبيليزاسيون پروتئاز قليايي حاصل از باسيلوس پلي ميكسا مورد آزمايش قرار گرفت و مشخص شد كه سيليس و پرليت براي اين كار ، مواد خوبي به شمار مي‏روند.

پروتئاز اچ‌آی‌وی

ویروس HIV برای عفونت سلول‌ها به دو نوع پروتئین به نام‌های پروتئین‌های ساختاری که فرآورده ژن Gag هستند و پروتئین‌های کاتالیتیکی که فرآورده ژنPol هستند، نیاز دارد.ژنوم ویروسی به چرایی غنی بودن از دید ژنی، برای بهبود همانند سازی نیاز به تکامل بخشیدن به سیستم‌های رونویسی و ترجمه دارند. از اینرو فرآورده‌های هر دو ژنهای Gag و Pol به گونه پلی پروتئین بیوسنتز و بدست یک پروتئاز به واحدهای عملگر جدا و تقسیم می‌گردد. پروتئینی که این عمل را تند می‌کند پروتئاز HIV نام دارد که خود فرآورده ژن Pol است. این پروتئاز از دید ساختاری همانندی فراوانی به آنزیم پپسین و دیگر آسپارتیک پروتئازها دارد. وجود دو اسید آمینه آسپارتیک نزدیک به هم در جایگاه پرکار ویژگی همه این پروتئازها است. این دو اسید امینه که pK بسیار متفاوت (pK یکی بیشتر و pK دیگری کمتر) نسبت بهpK معمولی آسپارتیک اسید، دارند در واکنش‌های اسید و باز همگانی برای هیدولیز پیوندهای پپتیدی شرکت می‌کنند. این پروتئاز از این دید با پپسین متفاوت است که جایگاه پرکار در میان دو زیر واحد یکسان پروتئاز قرار دارد ولی جایگاه پرکار در پپسین میان دو دومن (یا لوب) یک زنجیرهٔ پلی پپتیدی قرار دارد.

تصویر پروتئاز HIV

مکانیسم هیدرولیز پپتیدها بدست آسپارتیک پروتئازها

یکی از Asp‌های پروتونه شده، پروتون خود را به اکسیژن گروه کربنیل می‌دهد در همین حال Asp دیگر یک پروتون از آب گرفته و فرآوری نوکلئوفیل هیدروکسیل می‌کند، OH به کربن کربونیل حمله کرده ویک حدواسط چهار وجهی را فرآوری می‌کند. در این چگونگی نیتروژن پیوند یک پروتون ازAsp پروتونه می‌گیرد و انتهای آمینه پلی پپتید رها می‌گردد، Aspدیگر از یکی از OH پروتون گرفته و فرآوری گروه کربوکسیل را کاتالیز می‌کند. این آنزیم از دید ویژگی شکست پیوند در سلول‌ها بی همتا است.زیرا پیوند پپتیدی میان Phe یا Tyr و Pro را به گونه اختصاصی می‌شکنند.از اینرو تلاش‌هایی برای فرآوری داروهای مهار کنندهٔ آن انجام گرفته‌است این مهارکنندها ساختاری همانند به الیگوپپتیدها دارند. با این حال به انگیزه دگرگونی‌های مکرر پروتئاز در نسلهای ویروسی و وجود اثرات پهلویی بکارگیری این داروها دارای محدودیت‌هایی است. از جملهٔ این داروها Ritonavir ،Indinavirو Saquinavir را می‌توان نام برد.

مکانیسم آبکافت پپتید بدست پروتئاز HIV

كاربرد آنزيم‌ها در تكميل كالاي نساجي

در اين زمينه مي‌توان به عمل‌آوري الياف پروتئيني توسط پروتئازها و الياف سلولزي توسط سلولازها اشاره نمود. در كاربردهاي امروزي عمدتاً آنزيم‌ها بويژه آميلازها در آهارگيري، سلولازها در زيست‌پرداخت كالاهاي سلولزي و سنگ‌شويي كالاهاي جين و پروتئازها در عمل‌آوري پشم و ابريشم و بالاخره آنزيم‌ها در شوينده‌ها بكار مي‌روند. دورنماي استفاده از آن‌ها در ساير زمينه‌ها نيز مورد توجه محققان بوده و در حال پيشرفت مي‌باشد:

عمل‌آوري الياف پروتئيني توسط پروتئازها

پروتئازها، دسته‌اي از آنزيم‌ها هستند كه هيدروليز پيوند پپتيد در پروتئين را كاتاليز مي‌كنند. اين آنزيم‌ها به دو گروه عمدة زير تقسيم مي‌شوند:

1) اندوپپتيدازها كه پيوندهاي پپتيدي را از داخل زنجيره هيدروليز مي‌كنند.

2)كربوكسي پپتيدازها يا آمينو پپتيدازها كه پيوندهاي پپتيدي را از انتهاي زنجير هيدروليز مي‌كنند.

از مهمترين كارهاي انجام گرفته در زمينة استفاده از پروتئازها در نساجي مي‌توان به ضدآب‌رفتگي، سفيدگري پشم، صمغ‌گيري ابريشم و نيز آماده‌سازي چرم اشاره كرد.

عمل‌آوري پشم با آنزيم‌هاي پروتئاز

عمل‌آوري پشم با آنزيم‌هاي پروتئاز سبب افزايش راحتي (كاهش احساس خارش و افزايش نرمي) و نيز بهبود ظاهر سطح و خاصيت ضدپيلي در پشم مي‌شود. عمليات ضد آب‌رفتگي بر پاية اكسيدكردن و شكستن پيوندهاي عرضي دي‌سولفيد مي‌باشد و با استفاده از يك پروتئاز، كوتيكول ليف بطور كامل از بين رفته و ليف ضدنمدي مي‌شود. با استفاده از سرين پروتئاز، خاصيت آب‌دوستي پشم بهتر شده و سفيدي آن بيشتر مي‌شود.