مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

 

انواع محیط کشت:

کشت وتکثیر باکتریها در محیطهای مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتر ی شتاسی است. برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی - حرارت ورطوبت کافی- نمک- PH مناسب- حضور یاعدم حضوراکسیزن می باشد .

امروزه کشت باکتریها اغلب برروی محیطهای کشت مصنوعی صورت میگیرد. محیطهای کشت علاوه برتامین نیازهای غذایی وبسیاری نیازهای دیگر دارای ترکیباتی هستند که در تشخیص وشناسایی باکتریها نیزموثرند. زمانی که غلظت میکروارگانیسم کم باشد باانجام کشت تعداد باکتریها را میتوان افزایش داد ..

محیط های کشت به دو دسته تقسیم میشوند : محیط مایع ومحیط جامد.

برای انجام کشت در محیط مایع کافی است مقداری از نمونه رابه محیط اضافه نماید. باکتری درمحیط مایع پس از مدت زمان لازم(حدود چهار ساعت)به صورت کدورت یکنواخت- غیریکنواخت ویاپرده ظریفی درسطح محیط کشت ظاهر میشود.در صورتیکه باکتری در محیط جامد کشت داده شود پس ازمدت لازم (حدود شانزده الی هجده ساعت)بجز بعضی از مایکوباکترها(سه تا شش هفته)به صورت تودهای عظیمی درسطح محیط ظاهر میشود که کلنی نامیده می شود

اشكال محيط كشت

1 - لوله كشت مايعBroth tubes : لوله هاي شامل محيطهاي مايع مي باشد نوترين از قبيل تريبتي كيس سوي براث شامل سوبسترا براي رشد ميكروب از قبيل بانكراس - كلريد سد يم كه بس از تلقيح به 33 فرم ديده مي شود :

1- غشا نازكPellicle شامل يك توده اركانيسم شناور دربالاي محيط كشت(see Fig. 7A)

2- مه ألوديTurbidity اركانيسم همانند ابردر محيط ديده مي شود(see Fig. 7B)

3 - رسوبSediment توده اركانيسم ته نشين طاهر مي شود(see Fig. 7C).

2- لوله خوابيده(see Fig. 8A) و (see Fig. 8B)

3 - Stab tubes (see Fig. 9)

4 - بليت أ كارAgar plates كلني هاي مختلف را مي توان بااستفاده از مدل فوق شرح دادAppendix A

محیط آگارخوندار

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیطهای کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتریها راتامین می کندوهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط تادرجه چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید هموليز Bاستافيلوكوك اوروس

محیط شکلاتی

محیط کشت آگار شکلاتی که درآن گلبولهای قرمز به صورت لیز وجوددارد ازمحیطهای کشت مغذی است که رشداغلب باکتریها راتامین میکند. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگارپایه گه همان پایه آگارخوندار است کافی است که خون دردرجه حرارت هشتاد درجه سانتیگراد به محیط اضافه شود

محیط مولر هینتون

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطرواتوکلاونمودن محیط رادرپلیت های استریل تقسیم نمایید

محیطEMB

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتری های گرم منفی بسیار مناسب است. کلنی کلی باسیل برروی این محیط به صورت جلای فلزی یا درخشندگی متالیک ظاهر میگردند.

محیط مک کانکی آگار

در این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت جلوگیری می شودوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتریهای گرم منفی مناسب است. کلنی ها بر حسب استفاده باکتری ازلاکتوز بصورت لاکتوزمثبت(صورتی)ولاکتوز منفی(بی رنگ)ظاهر می شوند

MAC محيط انتخابي وافتراقي است

ارگانيسم هاي گرم منفي رشد كرده وگرم مثبت هارشد نمي كنند كه به علت وجود بايل نمك و كريستال ويوله است این محیط ، یک محیط انتخابی – افتراقی است که سبب رشد انتروباکتریاسه و باکتری گرم – میشود. حاوی مواد زیر است :
· پروتئین
· نمک صفراوی
· کلرید سدیم
· لاکتوز
· کریستال ویوله
· قرمز خنثی
عمل انتخابی محیط مربوط است به کریستال ویوله و نمک صفراوی که مانع رشد گرم + ها می شوند. آنها که لاکتوز + اند به رنگ قرمز صورتی اند که ناشی از تولید اسید از تخمیر لاکتوز و جذب آن توسط نوترال رد و بدنبال آن تغییر رنگ معرف به قرمز می باشد. لاکتوز – ها کلنی بی رنگ ایجاد می کنند .

محیطSS

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت وبسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلاوشیگلابخصوص ازنمونه مدفوع بسیار مناسب است

محیط بایل اسکولین آگار

این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرابرای شناسایی آنتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرابه برخی از استرپتوکوکها ازجمله آنتروکوک اجازه رشد میدهدوباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شودودر صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکزواسکولتین(یک مولکول الکلی می باشد)آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجادکمپلکس سیاه رنگ می شود

محیط لیزین آیرون آگار

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیلاسیون و دامیناسیون لیزین استفاده میشود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود

محیط مانیتول سالت آگار

در این محیط به علت حضور 7.5% نمک از رشد بسیاری از باکتریها جلوگیری شده ولی اساتفیلو کوکها به خوبی رشد می نماید . این محیط همچنین حاوی قند مانیتول و معرف فنول رد می باشد و در صورتی استافیلوکوک مورد نظر قادر به تخمیر مانیتول باشد باعث اسیدی شدن محیط و تغییر رنگ معرف به زرد می شوددر PH اسیدی فنل رد از قرمز به زرد تغییر رنگ می دهد .
استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس و ساپروفیتیکوس قادر به تولید اسید نیستند ، پس کلنی های قرمز تشکیل می دهند . این امر سبب افتراق اورئوس از ساپروفیتیکوس و اپیدرمیدیس می شود .

محیط کلیگر آیرون آگار

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود

محیط مالونات

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در استفاده از مالونات سدیم به عنوان منبع کربن استفاده می شود . تغییر رنگ محیط از سبز به آبی نشانه مثبت بودن تست است

 

 

 

محیطSIM

از این محیط برای بررسی حرکت باکتری توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 و تست اندول استفاده می شود.

 

Triple Sugar Iron Agar ( TSI

sh2این محیط برای شناسایی باسیل گرم – بر اساس توانایی تخمیر لاکتوز ، گلوکز و سوکروز و تولید :
میباشد محیط حاوی مواد زیر است· 1/0% گلوکز ، 1% لاکتوز ، 1% سوکروز
· منبع سولفور
· کلرید سدیم
· پروتئین
· معرف SH2
· فنل رد
تخمیر قندها توسط میکروارگانیزم همراه با تغییر رنگ است .
باکتری تخمیر کننده گلوکز مقادیر فراوانی از اسید را تولید می کند و رنگ محیط را زرد رنگ می کند . مواد قلیایی نیز در اثر دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو پپتون تولید می شود . این مواد قلیایی مقدار کم اسید تولید شده در سطح را که در اثر تنفس ایجاد شده خنثی می کند ، اما نمی تواند مقدار فراوان اسید ته لوله را خنثی کند . بنابراین بالای لوله قرمز و ته آن زرد است. K/A))
باکتری هایی که علاوه بر گلوکز می توانند لاکتوز و سوکروز را نیز تخمیر و تولید اسید کنند سبب زرد شدن کل لوله می شوند .( مقدار اسید تولیدی زیاد است ) A/A) )
عدم تغییر رنگ محیط نشاندهنده عدم تخمیر قندهاست که در این صورت احتمالا باکتری باسیل روده ای نیست .(K/K )
تولید گاز همراه با ایجاد ترک و حباب در محیط است . SH2 در نتیجه احیای تیوسولفات سدیم است . این گاز با سولفات آمونیوم فریک محیط ترکیب شده و رسوب سیاهی را ایجاد می کند . I است با این تفاوت که فاقد سوکروز می باشد .:

انواع کشت باکتری:

1- کشت باکتری در محیط کشت مایع (براث)

2- کشت باکتری در محیط کشت جامد(آگار)

 

 

 

روش کشت عمقی در لوله:

در اینحالت محیط کشت آگاردار (جامد) را با حفظ شرایط استریل در حالت مذاب داخل لوله های آزمایش استریل ریخته و بحالت عمودی آنرا در یک جای ساکن قرار دهید تا سرد سود در اینحالت با آنس نوک تیز استریل شده در کنار شعله از پرگنه باکتری مقداری را برداشته و آنرا بصورت عمودی در مرکز این محیط تا انتها فرو برده و بدون هیچگونه تغییر حالتی آنرا از همان مسیر خارج کنید . بعد لوله را در انکوباتور قرار دهید .

این روش کشت دارای خصوصیاتی می باشد و آن اینست که هنگامی که نوک آنس را در محیط فرو می برید در ابتدای ورود آنس به محیط تراکم باکتری زیاد است و به ترتیب که به عمق محیط فرو می رود از تعداد باکتریها کاسته می شود تا به انتهای لوله که می رسد تراکم باکتری با حداقل می رسد و از طرفی در انتها محیط کشت لوله ای اکسیژن کمتر از قسمت سطحی آن است و باکتریها به ترتیبی با تراکمی که وارد محیط شده اند براساس نیاز با اکسیژن (هوازی یا بیهوازی بودن )در محیط رشد متفاوتی دارند یعنی اگر باکتری هوازی باشد رشد آن در قسمت سطحی بیشتر است و اگر بیهوازی باشد رشد آن در قسمت عمقی بیشتر می شود.

روش کشت در سطح شیبدار در لوله :

در اینحالت محیط کشت آگاردار استریل را در لوله های استریل شده ریخته و قبل از سرد شدن آنها را بحالت شیبدار قرار می دهند تا سرد شوند. در اینحالت با آنس نوک تیز با حفظ شرایط استریل از پرگنه باکتری برداشته و در کنار شعله نوک آنس را ابتدا بصورت عمودی وارد قسمت عمودی محیط کشت کرده بعد به آرامی آنرا از همان مسیر خارج کرده و بدون اینکه نوک آنس از محیط جدا شود آنرا به حالت زیگزاک روی سطح شیبدار بکشید.

این روش هم خصوصیات بسیار زیادی از جهت تشخیص سویه های باکتری دارد و اطلاعاتی در مورد هوازی یا بی هوازی بودن آنها و همچنین خصوصیات منحصر به فرد باکتریها به ما می دهد . مثلا ممکن است درکشت یک نوع باکتری ، رنگ قسمت عمودی محیط کشت تغییرکند که نشانگر بی هوازی یا بیهوازی اختیاری بودن باکتری است که بعدا در تستهای اختصاصی دیگر را روی آن انجام می دهیم.یا مثلا باکتریها فقط در قسمت شیبدار رشد می کنند و رنگ آن قسمت تغییر می کند که پی به هوازی بودن آن می برید.

روش دیگر کشت روی این محیط از محیط مایع می باشد که یک لوپ از کشت مایع باکتریایی برداشته و در سطح شیبدار بصورت زیگراک می کشید و کشت می دهید.

یک باکتری در محیط‌کشت جامد یا مایع به دلایل مختلفی کشت می‌شود. در شکل سه نوع محیط‌کشت جامد را مشاهده می‌کنید.

کشت می‌تواند برای مشاهده‌ی تغییری باشد که کلنی روی محیط‌کشت افتراقی ایجاد می‌کند، یا برای گرفتن کلنی تک باشد، یا تنها برای ازدیاد باکتری، تجدید کشت و نگه‌داری آن باشد. مشاهده‌ی حرکت باکتری، رشد آنتاگونیسم دو یا چند باکتری در کنار هم، مشاهده‌ی هاله‌ی عدم رشد اطراف ماده‌ی خاص و بسیاری دلایل دیگر انجام شود. ما در این جا رایج‌ترین و پرکاربردترین روش‌های کشت را معرفی می‌کنیم.

کشتِ چهارمرحله‌ای روشی پرکاربرد می‌باشد که برای به دست آوردن تک‌کلنی و مشاهده‌ی تغییرات‌ ناشی از رشد باکتری در محیط‌کشت (مثل همولیز) روش مناسبی است.

در این روش مطابق شکل، از یک طرف پلیت شروع کرده و چند بار پلیت را به اندازه‌ی 60 تا 90 درجه می‌چرخانیم. در این روش از سوآپ استفاده نمی‌شود، چون با جذب باکتری به درون پنبه، در مقدار باکتری منتقل‌شونده ایجاد خطا می‌کند.

برای گرفتن تک کلنی پیش از هر مرحله لوپ را می‌سوزانیم و با گوشه‌ای از محیط کشت که با باکتری در تماس نیست سرد می‌کنیم. سپس یک بار از درون خطوط کشت مرحله‌ی قبل شروع می‌کنیم و تنها در آخرین مرحله از کشت

گرفتن کلنی تک از باکتری از این نظر اهمیت دارد که در صورت وجود سویه‌های دیگر باکتری، می‌توانیم از خلوص کلنی تکی خود مطمئن باشیم. زیرا هر کلنی منفرد تنها از یک عدد باکتری ایجاد شده است

کشت چمنی یک کشت یک‌نواخت در سطح پلیت به ما می‌دهد و بیش‌تر برای آنتی‌بیوگرام و سنجش هاله‌ی عدم رشد اطراف مواد مهارکننده‌ی رشد استفاده می‌شود. در این روش بیش‌تر از سوآپ برای پخش یک‌نواخت باکتری استفاده می‌شود. استفاده از لوپ نیز در حالت ممکن است. اما یک‌نواختی کشتی که با سوآپ انجام می‌شود بیش‌تر و به‌تر از زمانی است که باکتری‌ها با لوپ پخش شده‌اند. اگر کشت اولیه‌ی باکتری به صورت مایع باشد، می‌توان با سمپلر نمونه‌ی مایع را روی محیط‌کشت جامد ریخت و بعد با یک پخش‌کننده (spreader) ی استریل، سوسپانسیون را در همه‌جای محیط‌کشت پخش کرد.

آنتی‌بیوگرام و هاله‌ی عدم رشد اطراف دیسک‌های آنتی‌بیوتیک روی کشت چمنی

پخش‌کردن باکتری روی محیط‌کشت جامد به کمک پخش‌کننده

کشت چندبخشی هم اغلب برای نگه‌داری سویه‌های میکروبی متعدد و صرفه‌جویی در مصرف محیط‌کشت به مدت کوتاه در یخچال انجام می‌گیرد.

در این روش پلیت از قسمت کف با مارکر به چند بخش تقسیم شده و سویه‌های متفاوت بین خطوط کشت داده می‌شود.

روش‌های کشت

یک باکتری در محیط‌کشت جامد یا مایع به دلایل مختلفی کشت می‌شود. در شکل سه نوع محیط‌کشت جامد را مشاهده می‌کنید.

کشت می‌تواند برای مشاهده‌ی تغییری باشد که کلنی روی محیط‌کشت افتراقی ایجاد می‌کند، یا برای گرفتن کلنی تک باشد، یا تنها برای ازدیاد باکتری، تجدید کشت و نگه‌داری آن باشد. مشاهده‌ی حرکت باکتری، رشد آنتاگونیسم دو یا چند باکتری در کنار هم، مشاهده‌ی هاله‌ی عدم رشد اطراف ماده‌ی خاص و بسیاری دلایل دیگر انجام شود. ما در این جا رایج‌ترین و پرکاربردترین روش‌های کشت را معرفی می‌کنیم.

کشت خطی به کمک لوپ حلقه‌ای به صورت یک خط ممتد انجام می‌شود و در بسیاری موارد چند نوع باکتری را به صورت عمود بر هم کشت می‌دهند. این روش معمولاً برای مشاهده‌ی اثر آنتاگونیستی دو یا چند میکروب بر هم انجام می‌شود. برای مثال در شکل زیر خط وسط یک باکتری مشکوک به تولیدکننده‌ی آنتی‌بیوتیک است که مواد بیرون سلولی تولید می‌کند. در صورتی که آنتی‌بیوتیک جزو مواد بیرون سلولی این باکتری جداشده از محیط باشد، کشت خطی باکتری‌های استافیلوکوکوس، اشریشیا کلی و میکروکوکوس اطراف آن، در نزدیکی این باکتری متوقف می‌شود.

کشت عمقی با استفاده از لوپ سوزنی برای مشاهده‌ی حرکت باکتری در محیط‌کشت نیمه‌جامد با درصد آگار کم درون لوله‌ی آزمایش انجام می‌شود. در شکل زیر دو محیط کشت نوترین‌آگار درون لوله‌ی آزمایش می‌بینید که باکتری در آن‌ها به صورت عمقی کشت داده شده است. در لوله‌ی سمت چپ باکتری تنها در مسیر کشت رشد کرده است، زیرا توانایی حرکت ندارد. اما در لوله‌ی سمت راست همه‌ی محیط کدر شده است. یعنی باکتری توانایی حرکت داشته و در کل محیط پخش شده است.

کشت شیب‌دار محیط‌کشت جامدی است که در لوله‌ی آزمایش مطابق شکل برای ایجاد شرایط کم‌هوا در ته لوله‌ی آزمایش و مشاهده‌ی کارکرد باکتری در شرایط کم‌هوا (میکروآئروفیل) انجام می‌شود. معمولاً محیط‌کشت‌های جامد مورداستفاده در این حالت دارای معرف‌های شیمیایی هستند که انجام تخمیر و تولید اسید توسط باکتری‌هایی که می‌توانند شرایط کم‌هوا را تحمل کنند، نشان می‌دهد.

کشت بی‌هوازی برای باکتری‌های بی‌هوازی انجام می‌شود. در این روش یک ظرف دربسته به نام جار به کار برده می‌شود

که پلیت‌ها درون آن قرار می‌گیرد. یک شمع درون جار روشن می‌شود تا هوای موجود در آن را مصرف کند. شمع پس از مصرف تمام اکسیژن موجود در جار خاموش می‌شود و شرایط بی‌هوازی (بدون اکسیژن) را برای میکروب‌های بی‌هوازی فراهم نمود.