مرکز دانلود خلاصه کتاب و جزوات دانشگاهی

بررسی اثرات محافظتی عصاره متانولی گیاهان Emblica officinalis و Terminalia chebulaو Terminalia bellerica بر آسیب سلول های PC12 ناشی از محرومیت سرم گل

 

چکیده:

محرومیت از سرم وگلوکز باعث مرگ در سلول های فئوکروموسایتومای مدولای آدرنال می شود. این مدل برای بررسی ایسکمی مغزی ، مدل بسیار مناسبی است.

امروزه bellericaTerminalia chebula,Terminalia Emblica officinalis,به عنوان منابع غنی از آنتی اکسیدانت شناخته شده اند. جهت نشان دادن تاثیر محافظت عصبی عصاره

bellericaTerminalia chebula,Terminalia Emblica officinalis, در محیط برون تن، تاثیرآنها، بر روی سلول های PC12تحت شرایط محرومیت از سرم/گلوکز بررسی شد.

روش کار:

سلول های PC12در DMEM حاوی 10% سرم جنینی و آنتی بیوتیک (پنی سیلین-استرپتومایسین) کشت داده شدند، سپس سلول ها در شرایط محرومیت از سرم/گلوکز برای مدت18 ساعت قرار داده شدند.

سلول ها با غلظت های مختلف bellericaTerminalia chebula,Terminalia Emblica officinalis,پیش تیمار شدند. توانایی حیات سلول ها با تست MTTارزیابی شد. برای اندازه گیری رادیکال های آزاد اکسیژن درون سلولی، بعد از 18 ساعت ایسکمی، سلول هابا غلظت µM 5،DCF-DA در دمای 37 درجه برای 30 دقیقه در محیط تاریک انکوبه شدند ماده فلورسانس2,7دی کلروفلورسین محصول اکسید شده 2,7دی کلرو دی هیدروفلورسین در طول موج 480 نانومتر تحریک شد و در طول موج570 نانومتر، نشر آن توسط فلوسایتومتر مشاهده می شود. پروب ملکولی DCF-DA برای اندازه گیری میزان ROSدرون سلولی توسط فلوسایتومتر استفاده شد. ROS باقرار دادن سلول ها در شرایط محرومیت از سرم/گلوکز برای 18 ساعت با پیش تیمار باعصاره هااندازه گیری شد.

نتیجه گیری:

در مقایسه با گروه کنترل، محرومیت از سرم/گلوکز باعث افزایش سلول هایDCF مثبت شد.در حاليكه پس از تاثير عصاره ها ميزان زنده ماندن سلول ها بيشتر بود و كاهش گونه هاي فعال اكسي‍ژن توسط تست فلوسايتومتري اثبات گرديد.

نتایج، ارزش بالایbellericaTerminalia chebula, Terminalia Emblica officinalis,را در درمان بیماری هایی مانند ایسکمی مغزی نشان داد.

کلمات کلیدی:

PC12; Serum/Glucose free; Toxicity; Embelica officinalis , Terminalia belerica, Terminalia chebula

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول:

کلیات

مقدمه

ضرورت انجام تحقیق

اهداف پژوهش

سئوالات و فرضیه ها

تعاریف بنیادی

1-1- مقدمه:

بر طبق آمار سازمان بهداشتجهانی(WHO) سالانه میلیونها نفر به سکته قلبی و مغزی، ایسکمی اندام ها، دیابت و آلزایمر و آمیوتروفیک لترال اسکلروزیز و پارکینسون مبتلا می شوند. سكته‌ي مغزي سومين علت شايع مرگ در امريكا و شايع‌ترين اختلال نورولوژيك ناتوان كننده مي باشد كه ميزان بروز آن با بالا رفتن سن افزايش يافته و شيوع آن در مردان بيشتر از زنان مي‌باشد. سالانه 000/750 سكته جديد رخ مي‌دهد و در حدود 000/150 نفر در ايالات متحده امريكا به دليل سكته مي‌ميرند.

با مطالعه برروی این بیماریها مشخص شد که در تمام این بیماریها رادیکال های آزاد،افزایش پیداکرده است. رادیکال آزاد، به ترکیبی گفته می شود، که دارای یک یا بیشتر الکترون جفت نشده بوده؛ لذا واکنش پذیری زیادی دارد. گونه های فعال اکسیژن(Reactive Oxygen Spesies) ، شایع ترین فرم رادیکال آزاد میباشد.رادیکال های آزاد، به سلول، آسیب های فراوانی می رسانند.درمقابل، آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که از طریق جاروب کردن رادیکال های آزاد، سیستم های زیستی را در برابر رادیکال های آزاد محافظت می کنند. از مهمترین آنزیم های آنتی اکسیدان، می توان به سوپراکسید دیسموتاز(SOD)،کاتالاز(CAT)، گلوتاتيون ردوكتازوگلوتاتیون پراکسیداز(GSH-PX)اشاره کرد.

تصوير1-1:

امروزه مطالعات زیادی برروی اثرات آنتی اکسیدان و محافظتی گیاهان به عنوان يك تدبیر درماني جهت كنترل بهتر بيماري هايي كه در پاتوژنز آنها، راديكال هاي آزاد نقش دارند، صورت مي پذيرد.

از آنجا كه فعاليت آنتي اكسيداني و جاروب كنندگي راديكال هاي آزاد، براي

bellericaTerminalia chebula,Terminalia Emblica officinalis,گزارش شده است، ایده اين مطالعه ارزيابي اثر محافظتي اين تركيبات بر روي آسيب ناشي از محروميت از سرم/ گلوكز در سلول هاي PC 12 مي باشد.

1-2- اهداف پژوهش:

مطالعه اثر محافظتی ,Emblica officinalis,Terminalia chebula,Terminalia bellericaبه عنوان ترکیب بالقوه در جلوگیری از مرگ سلول های pc12 تحت شرايط آسيب اكسيداتيو ناشي از محروميت از سرم/ گلوکز.

این مطالعه می تواند نشان دهنده کاربرد دارو در آسیب های حاد نظیر ایسکمی و سکته قلبی و مغزی و آسیب های مزمن مانند آلزایمر و ایسکمی اعضا باشد.

1-3- سئوالات و فرضیه ها:

آیا ,Emblica officinalisTerminalia chebula,Terminalia bellericaبر روي مرگ سلولي ناشي از محروميت سرم/گلوکز در رده سلولی pc12 اثر محافظتی دارد؟

1-4- تعاریف بنیادی:

1-4-1: رادیکال آزاد: اجمالا به ترکیبی گفته می شود که دارای یک یا بیشتر الکترون جفت نشده بوده، لذا واکنش پذیری زیادی دارد.لازم به ذكر است، افزایش تولید رادیکال های آزاد با صدمه به غشاء سلول، باعث گسسته شدن غشاء سیتوپلاسمی می شود؛ لذا به طور طبیعی آنزیم های گلوتاتیون پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز، رادیکال های آزاد را احیاء می کنند. آسیب وارده به غشاء سلول، به خاطر استرس اکسیداتیو، باعث خروج آنزیم های آنتی اکسیدانی از سلول می شود که پیامد آن، آسیب پذیری بیشتر، نسبت به رادیکال های آزاد است. (1)

1-4-1-1:مبانی رادیکال های آزاد و آسيب اكسيداتيو:

اكسيژندر جريانمتابوليسم اكسيداتيو؛درارگانيسم هاي هوازيبه عنوانگيرنده نهاييدرزنجيرهانتقال الكترون عمل كرده و لذاراديكالهاي آزاد اكسيژن، شايعترين فرم راديكال هاي آزاد مي باشند. اضافه شدن یک ، دو یا سه الکترون به اکسیژن مولکولی به ترتیب منجر به تولید سوپر اکسید ، هیدروژن پراکسید و هیدروکسیل می شود. امروزهعمدتاازاصطلاح گونههايفعالاكسيژن(ROS) استفادهميشود،چرا كه اكسيژن تكي، پراكسيد هيدروژن،ليپو پراكسيدها،هيدروپراكسيدها، واپوكسيد ليپيدهاي اندوژنواسيد هيپوكلرو نيزداراي گروههاي فانكشنالو بسيار فعالاكسيژنبوده؛ اماراديكال آزادمحسوب نميشوند.مع الوصف ROS ، يک محصول ثانويه طبيعي هم هست که از متابوليسم نرمال اکسيژن بدست مي آيد و نقش مهمي را در سيگنالهاي درون سلولي دارد.

تصوير1-3- ROS شامل راديکالها و غير راديکالها مي باشد.بيشتر مولکولهاي بيولوژيکي غيرراديکال، شامل دو جفت الکترون جفت شده در اوربيتال مي باشند؛ که يک شکل مناسب در يک مولکول است .يک راديکال آزاد، مولکولي است که مي تواند غير وابسته باشد وداراي يک يا چند الکترون جفت نشده است.

تصوير1-4: توليد ROS در طي تنفس سلولي: تنفس فرايندي است که مولکولهاي غذا با اکسيژن واکنش داده و به دي اکسيد کربن و آب، شکسته مي شوند(با به دام انداختن انرژي به شکل ملکولهاي ATP).

در حدود 5درصد زمان ،اکسيژن با واکنش بالاي سوپر اکسيد احياء شده است . اين احتمال موجب انتقال(نشت) يک الکترون منفرد تنها، در يک مکان خاص از زنجيره انتقال الکترون ميتوکندري مي شود.وقتي که سوپر اکسيد، متحمل احياء بيشتري مي شود، H₂O₂ و راديکال هيدروکسيل (فوق العاده واکنشگر)، تشکيل شده است که بطور خودبخودي يا تحت تاثير آنزيمهاي مختلف اتفاق مي افتد .مرحله تغيير از H₂O₂ به راديکال هاي هيدروکسيل، در حضور فلزات همچون آهن يا مس انجام می پذیرد و همچنين این مرحله در معرض تابشهاي يونيزه کننده هم، اتفاق مي افتد.

تصوير1-5-متابوليسم ROS:ROS دربدن انسان، دائما تشکيل مي شود.بعنوان محصول متابوليسم داخل سلولي و تنظيم کننده داخل سلولي است که بوسيله آنتي اکسيدانها حذف مي شود .آنتي اکسيدانت ماده اي است که توانائي در تاخير يا پيشگيري از مواد اکسيد کننده (ROS) دارد.اثر شديد ROS در بدن داراي دو نوع است مثبت و منفي.ROS براي کشتن باکتريها و ديگر ارگانيسم ها استفاده شده است؛ البته يک محصول قوي ROS به استرس اکسيداتيو و بيماري منجر مي شود. اخيرا کشف شده است که ROS بعنوان مثال H₂O₂ ، يک اکسيدانت زيان آور براي سلولهاست؛ البته از طرفی هم نقش مهمي را بعنوان ملکول سيگنال دهنده مفيد، بازي مي کند.

H₂O₂ در پر اکسيزوم ها تشکيل شده و به تجزيه اسيد هاي چرب و ديگر ملکولها کمک مي کند و براي واکنشهاي دفع مسموميت استفاده می شود.

یون منفی سوپر اکسید در میتوکندری به طور مداوم تشکیل می شود . میزان O^2- به مقدار اکسیژن جاری در میتوکندری بستگی دارد. رادیکال های هیدروکسیل، عمر کوتاهی دارند؛ ولی آسیب رسان ترین رادیکال های داخل بدن هستند. فعل و انفعالات مس و آهن نیز آن را تولید می کند؛ که اولین بار توسط فنتون مشاهده شد.

هیدروژن پر اکسید، می تواند به رادیکال هیدروکسیل که به شدت، آسیب رسان است؛ تبدیل شود و یا می تواند، کاتالیز شود و به شکل آب بدون ضرر، دفع شود.

گلوتاتیون پر اکسید، برای تبدیل گلوتاتیون به گلوتاتیون اکسید شده، ضروری است که در طی آن H₂O₂ به آب تبدیل می شود که اگر به آب تبدیل شود؛ اکسیژن منفرد تشکیل می شود.

اکسیژن منفرد، یک رادیکال آزاد نیست؛ اما هنگام واکنش های رادیکالی، می تواند تشکیل شود و باعث واکنش بیشتر شود ( به عنوان کاتالیزور).

1-4-1-2-تاثیرات تشکیل رادیکال های آزاد:

تولید متعادل رادیکال های آزاد برای تنظیم فعالیت های فیزیولوژیکی ضروری است؛ ولی تولید نا متعادل آن به خصوص گونه فعال اکسیژن، باعث آسیب اکسایشی به DNA و RNA ، پروتئین ، لیپید ها می گردد همچنین باعث بیماری های قلبی و عروقی – سرطان – آلزایمر – پارکینسون و دیابت نوع II می شود .

1-4-1-3-مکانیزم های تولید رادیکال های آزاد :

1-4-1-3-1- الف : زنجیره انتقال الکترونی میتو کندری :

اکسیژن مصرفی از طریق انتقال الکترونی احیاء می شود . NADH یوبیکینون ردوکتاز و یوبیکینون سیتوکروم C ردوکتاز ، O^2- و H₂O₂ تولید می کنند . به علت انتقال از دو حامل الکترون (FADH2 , NADHH) به یک حامل الکترون (یوبیکینون)

1-4-1-3-2-ب: مسیر اکسانتین یا اکسانتین اکسیداز:

واکنش کاتالیز اکسانتین اکسیداز، یکی از منابع مهم تولید رادیکال های آزاد درايسکمی خون رسانی مجدد (E/R) قلب است . ( هنگام ايسکمی ATP به ADP و AMP تجزیه و به علت این که عضله قلبی و در حال انقباض نیاز به انرژی دارد . در صورت عدم حضور اکسیژن کافی برای باز سازی ATP توسط فسفریلاسیون اکسایشی ، AMP به طور مداوم تجزیه و منجر به تراکم هایپوکسانتین می شود که توسط اکسانتین اکسیداز به اکسانتین و اسید اوریک تبدیل می شود .

در فاز رپرفيوژن،به دليل غلظت بالاي اكسيژن در بافت و اختلال در عملكرد ميتوكندريها، مقادير زيادي آنيون سوپراكسيد(O^2-) و ROS توليد مي شود.

از سوي ديگر متابوليسم آراشيدونيك اسيد (از طريق مسيرهاي سيكلواكسيژناز و ليپواكسيژناز) موجب توليد ايكوزانوييدها (كه مدياتورهاي التهابي قوي هستند)، آنيون سوپر اكسيد و ساير راديكال هاي آزاد مي گردد. فرايند التهابي ايجاد شده موجب مهاجرت لكوسيتها به محل شده و آنزيم ميلوپراكسيداز موجود در اين سلول ها نيز به عنوان منبعي براي توليد راديكال هاي آزاد عمل مي نمايد. تجزيه متابوليت‌هاي ATP (نوكلئوتيدهاي آدنيل همانند اينوزين و هيپوگزانتين) از طريق مسير گزانتين اكسيداز نيز موجب توليد راديكالهاي آزاد (آنيون سوپراكسيد و پراكسيد هيدروژن) مي‌گردد. البته در شرايط عادي ميزان آنزيم گزانتين اكسيداز، پايين است؛ اما در جريان ايسكمي، كالپائين فعال شده بوسيله كلسيم، آنزيم گزانتين دهيدروژناز را به گزانتين اكسيداز تبديل مي كند و به اين ترتيب اهميت اين مسير بيشتر مي گردد. و سرانجام اينكه فعال شدن آنزيم NOS^[1] (در نتيجه افزايش كلسيم داخل سلولي) و القاء ‌آن در نتيجه التهاب، باعث توليد نيتريك اكسايد (NO) مي‌گردد كه با تشكيل آنيون پراكسي نيتريت (ONOO^-) درتوليد راديكالهاي آزاد (راديكال هيدروكسيل و دي اكسيد نيتروژن) نقش دارد. اين راديكالهاي آزاد علاوه بر آسيب اکسيداتيو پروتئين ها و اسيدهای نوکلئيک، به چربيهاي غشاء نيز حمله كرده و باعث پراكسيداسيون چربيهاي غشاء مي گردند.

تصوير1-6:واكنش فنتون و نقش آهن در توليد راديكال هيدروكسيل

تصوير1-7: مراحل توليد گونه هاي فعال اكسيژن :(ROS)

چربي هاي غير اشباع موجود در غشاهاي سلولي (PUFA) نسبت به حمله راديكال هاي آزاد، بسيار حساس هستند؛ چرا كه اتصالاتدوگانه موجود در زنجيره جانبي اين چربي ها، غني از الكترون بوده و به راحتي بوسيله ROS ، اكسيده مي گردند. واكنش زنجيره اي پراكسيداسيون چربي ها، منجر به توليد فرم هاي هيدروپراكسيدي، پراكسيدي و الكلي اسيدهاي چرب مي گردد؛ كه سپس در حضور آهن آزاد (Fe²⁺) به چندين فراورده آلدئيدي سمي از جمله مالون دي آلدئيد (MDA)، 4- هيدروكسي نوننال ( 4-HNE) و آكرولئين(سرطان زا)، شكسته مي‌شوند. اين واكنش ها در نهايت، منجر به از دست رفتن يكپارچگي و سياليت غشاهاي سلولي، تغيير در نفوذپذيري غشاء (ايجاد شكاف در غشاء) و تغيير در فعاليت گيرنده ها و آنزيم هاي متصل به غشاء مي گردد. آسيب اكسيداتيو پروتئين ها نيز مي تواند منجر به افزايش گروههاي فعال كربونيل (ايجاد پروتئين كربونيل ها)، كاهش گروههاي سولفيدريل(SH)، افزايش اتصالات دي سولفيدي (-S-S-)، كاهش گروههاي آميني، تشكيل دي تيروزين، نيتروزيله شدن ريشه هاي تيروزين (بوسيله پراكسي نيتريت)، تخريب تريپتوفان و تشكيل N– فرميل كايرونين گشته كه در نهايت باعث قطعه قطعه شدن، ايجاد اتصالات عرضي، ايجاد Protein adduct و غير فعال شدن پروتئين مي گردد.

آسيب DNA بوسيله راديكال هاي آزاد، نيز موجب تغييرات ساختاري همانند شكست در زنجيره هاي DNA ، نوآرايي، موتاسيون، حذف ، اضافه شدن و غيره مي گردد. شايعترين تغيير، تبديل دزوكسي گوآنين به 8- هيدروكسي دزوكسي گوآنين مي باشد؛ كه به نوبه خود متيلاسيون ريشه هاي سيتوزين مجاور بوسيله آنزيم مربوطه را تحت تاثير قرار مي دهد. الگوي طبيعي متيلاسيون ريشه هاي سيتوزين، براي تنظيم بيان ژن ها، ضروري است . در جريان آسيب اكسيداتيو، بيان ژن نيز دستخوش تغيير مي گردد. نشان داده شده است كه در جريان ايسكمي فراگير مغزي، فاكتور نسخه برداريNuclear factor-κB (NF-κB) به طور مداوم، فعال مي گردد. NF-κB بيان تعداد زيادي از ژن ها و از جمله سيكلواكسيژناز-2، نيتريك اكسايد القائي، متالوپروتئيناز، مولكول هاي چسبنده بين سلولي و سيتوكاين ها، را القاء كرده و در نتيجه موجب تحريك بيشترتوليد ROS، سيتوكاين هاي التهابي و سموم تحريكي مي گردد. از مجموع مطالب فوق مي توان چنين نتيجه گرفت؛ كه آسيب اكسيداتيو و حوادث مولكولي ناشي از آن، در نهايت منجر به مرگ نورون ها، شامل نکروز یا آپوپتوز مي گردد.

از طرف ديگر رابطه دو طرفه و متقابلي نيز بين رهايش اسيدهاي آمينه تحريكي (EAA) و توليد راديكال هاي آزاد وجود دارد.

آزادسازي EAA ، توليد ROS را تحريك مي كند و در مقابل ROS نيز، رهايش EAA را افزايش مي دهد.

تصوير1-8: واكنش زنجيره اي پراكسيداسيون چربي ها:

1-4-1-4-آنتي اكسيدان ها:

آنتي اكسيدان ها تركيبات درون زا و يا برون زايي هستند؛ كه از طريق جاروب كردن راديكال هاي آزاد، مهار توليد ROS و يا شلات كردن يون هاي فلزي (كه توليد ROS را كاتاليز مي نمايند)؛ سيستم هاي بيولوژيك را در برابر آسيب اكسيداتيو ناشي از راديكال هاي آزاد، محافظت مي نمايند.

سيستم آنتي اكسيدانتي طبيعي كه در تمام سلول ها يافت مي شود را مي توان به دو گروه عمده تقسيم كرد:

1-آنزيم ها و آنتي اكسيدانت هاي با وزن ملکولی بالا (HMWA)

2-آنزيم ها و آنتی اکسیدانت های با وزن مولكولي پايين² (LMWA).

آنتی اکسیدان های با وزن مولکولی کم:(این گروه دارای زیر تقسیم است)

1-4-1-4-1- آنتی اکسیدان های محلول در چربی(توکرفرول، کارتنوئیدها، کوئینون، بیلی روبین و معدودی پلی فنل ها.

1-4-1-4-2- آنتی اکسیدان های محلول در آب (اسکوربیک اسید، اوریک اسید، اغلب پلی فنل ها).

آنتی اکسیدان های با وزن مولکولی کم، آسیب ناشی از رادیکال آزاد را به تأخیر می اندازند یا مهار می کنند. این آنتی اکسیدان ها تمایل به تجمع در لیپو پروتئین های چربی پلاسمای خون به عنوان LDL، دارند. این آنتی اکسیدان ها، نمی توانند وارد بخش چربی LDL (لیپو پروتئین با دانسیته ی پایین) شوند. از مهمترين آنزيم هاي آنتي اكسيدانت(LMWA) مي توان به سوپر اكسيد ديسموتاز³ (SOD) ، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و گلوتاتيون ردوكتاز اشاره كرد. گروه LMWAA از آنتي اكسيدانت ها را نيز مي توان به دو زير گروه آنتي اكسيدانت هاي با عمل مستقيم (همانند جاروب كننده هاي راديكال هاي آزاد) و آنتي اكسيدانت هاي با عمل غير مستقيم (همانند عوامل شلات كننده) تقسيم كرد. آنتي اكسيدانت هاي با عمل مستقيم، در محافظت در برابر آسيب اكسيداتيو، داراي اهميت ويژه بوده و صدها نوع ازاين تركيبات شناخته شده اند؛ که نقش مهمي را بعنوان آنتي اکسيدانتهاي داخل سلولي بازي ميکنند ، مانند: ويتامين C ، ويتامين E (ویتامین E به خاطر محلول در چربی بودنش، مهم ترین است.)، α- ليپوئيك اسيد، گلوتاتيون (GSH) ، اوريك اسيد(مهمترين آنتي اکسيدان پلاسما در انسان)، ملاتونين، كارتنوئيدها (β- كاروتن)، فلاونوئيدها، ترپنوئيدها و غيره.

از آنتي اكسيدانت هايي كه از طريق مهار توليد ROS عمل مي نمايند، مي توان به مهار كننده هاي آنزيم هاي NOS(N^G-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME) و XO (آلوپرينول) اشاره کرد.

آنزیم ها ی اکسایشی ( آنزیم های گلیکولپتیک و اسید سیتریک و زنجیره سیتو کروم ها)، می توانند بدون رهایش رادیکال های آزاد ، اکسیژن را احیا کنند.

1-4-1-5-تاثيرات مضر انواع واکنش اکسايش روي سلول:

1- آسيب DNA

2- اکسيداسيون اسيدهاي چرب غیر اشباع در چربيها

3- اکسيداسيون اسيدهاي آمينه در پروتئين ها

4- انواع اکسيداسيون غيرفعال کننده توسط اکسيداسيون کوفاکتورها

1-4-1-6- اثرات مضر رادیکال های آزاد :

رادیکال های اکسیژن و گونه های فعال که آن ها تولید می کنند، اندازه و شکل ترکیباتی که با آن ها واکنش نشان می دهند، را تغییر می دهند.

رادیکال های اکسیژن محور، باعث پاره شدن زنجیره های DNA و آسیب به بازهای مزدوج می گردد.

کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز، توسط O^2- غیر فعال می شوند. که پیامد آن افزایش H₂O₂ داخل سلولی می باشد؛ که به اسید های نوکلئیک آسیب می رساند .

آنزیم لاکتات دهیدروژناز با O^2- واکنش نشان می دهد . NADH آزاد به آسانی با O^2- واکنش نشان نمی دهد؛ به هر حال وقتی NADH به لاکتات دهیدروژناز متصل می شود؛ ممکن است توسط O^2- برای تولید NAD⁺ اکسید شود . سپس NAD ممکن است واکنش های رادیکال زنجیره ای را آغاز کند. یا با O² برای تشکیل NAD⁺ و O^2- واکنش نشان دهد .

این واکنش ها، توان احیا کنندگی لاکتات دهیدروژناز را از بين مي برد. رادیکال های آزاد، ممکن است به طور غیر مستقیم نیز، از طریق تغییر ساختمان غشاء، فعالیت آنزیم را تغییر دهند .

نشان داده شده که رادیکال های آزاد، در بسیاری از بیماری های انسان نقش دارند.

1-4-1-7-ارزيابي آسيب اكسيداتيو:

شواهد متعددي نشان مي دهد كه توليد بيش از حد و غير قابل كنترل راديكال هاي آزاد و آسيب اكسيداتيو ناشي از آن؛ نقش بسيار مهمي در پاتوفيزيولوژي بسياري از بيماريها دارد؛ كه از آن جمله مي توان به بيماري هاي التهابي و اتوايميون، پيري ، اختلالات نورودژنراتيو (همانند آلزايمر و پاركينسون و آمیوتروفیک لترال اسکلروزیز)، اختلالات قلبي- عروقي و آترواسكلروز، سرطان و كارسينوژنز ناشي از تركيبات شيميايي، آسيب ايسكميك- رپرفيوژن، سميت ناشي از تركيبات شيميايي، فلزات و واكنشهاي دارويي، اختلالات تنفسي همانند سندرم هاي ديسترس تنفسي و آمفيزم، ديابت و بسياري اختلالات ديگر اشاره كرد. روش هاي متعدد محیط برون تني،جهت ارزيابي حدودی ميزان آسيب اكسيداتيو محیط درون تني، مورد استفاده قرار مي گيرد. اين روش ها، عمدتا بر اساس اندازه گيري بيوماركرها مي باشند. منظور از بيوماركر اصطلاحا تغييرات و يا فراورده حاصل، از جمله راديكال هاي آزاد به يك شرايط (مثلا وضعيت آنتي اكسيداني) و يا مولكول بيولوژيك (مثلا پروتئين، چربي و يا DNA ) مي باشد.

اغلب اثرات زیان آور بالقوه اکسیژن، ناشی از شکل گیری تعدادی ترکیبات شیمیایی است که آن ها را به نام گونه های فعال اکسیژن (ROS) می شناسیم؛ که تمایل به دادن اکسیژن، به دیگر مواد دارند. (3)

گونه های فعال اکسیژن (ROS)، واژه ای است که شامل رادیکال های اکسیژن و چندین ترکیب اکسیدکننده غیر رادیکال به عنوان مثال هیپو کلروس اسید(HOCL)، پراکسید هیدروژن(H₂O₂) و اوزون(O₃) می شود.

اغلب این گونه های فعال، رادیکال های آزاد هستند و یک یا چند الکترون آزاد دارند، که جفت نشده است؛ پس ناپایدار و بسیار واکنش پذیر است.

آسیب اکسیداتیو؛ حتی منجر به سرطان زایی، پیری و تصلب شرائین می شود.

این گونه های فعال اکسیژن، با آنتی اکسیدانت های دارای منشأ خارجی و دارای منشأ داخلی، واکنش می دهند.

آنتی اکسیدانت ها گروهی از مواد هستند که هنگامی که در حد غلظت های کم هم، در معرض مواد اکسید شونده باشند، به طور قابل توجهی فرآیندهای اکسیداتیو را به تأخیر می اندازند یا مهار می کنند [به این نحو که خودشان اکسید می شوند. [

گونه های فعال اکسیژن عبارتی است که شامل گونه های رادیکالی و غیر رادیکالی می باشد که در شروع یا گسترش واکنش های زنجیره ای، شرکت می کنند.

رادیکال های آزاد، ترکیبات شیمیایی حدواسط شدیداً فعال، به دلیل حضور الکترون جفت نشده، در ساختارشان هستند.

1-4-1-8-منابع تولید رادیکال آزاد:

1-منبع داخلی، 2-منبع خارجی، 3-فاکتورهای فیزیولوژیکی

1-4-1-8-1-منابع داخلی:

منابع داخلی واکنش های آنزیمی شامل:

الف) واکنش های درگیر در زنجیره ی تنفسی، ب) فرآیند فاگوستیوز، ج) فرآیند پروستاگلاندین، د)سیستم سیتوکروم P450

برخی از واکنش های میتوکندریایی، زانتین اکسیداز، فاگوستیوز، واکنش های درگیر با Fe، پراکسی زوم، مسیر آراشیدونیک اسید، سکته، التهابات

1-4-1-8-2-منابع خارجی:

منابع خارجی شامل:

واکنش های غیر آنزیمی اکسیژن با ترکیبات آلی است.

رادیکال های آزاد همچنین به دلیل واکنش هایی که توسط تشعشع یونیزان رادیو اکتیو شروع می شوند، به وجود می آیند. برخی دیگر از منابع خارجی رادیکال های آزاد شامل: نور فرابنفش، اوزون، آفت کش ها، داروهای بیهوشی و حلال های صنعتی هستند. برخی شرایط روحی مانند استرس، مسئول شکل گیری رادیکال های آزاد هستند.

1-4-1-9-آسیب های ناشی از رادیکال های آزاد:

اگر رادیکال های آزاد، غیر فعال نشوند؛ فعالیت شیمیایی آن ها می تواند به همه ی ماکرو مولکول های سلولی، شامل پروتئین، کربو هیدرات، لیپید، اسید نوکلئیک، آسیب وارد کند.اثرات تخریبی روی پروتئین ها، می تواند سبب شکل گیری برخی بیماری ها مانند کاتاراکت (آب مروارید) شود.آسیب رادیکال های آزاد به DNA، منجر به موتاسیون و اثر آن روی کلسترول LDL، منجر به بیماری های قلبی می شود.رادیکال های آزاد همچنین مسئول پیری هستند.

1-4-1-9-1-آسیب اکسیداتیو به پروتئین ها:

حمله ی اکسیداتیو به پروتئین ها، منجر به تغییر اسید آمینه ها، یا قطعه قطعه شدن زنجیره ی پپتید، تجمع محصولات واکنشی پیوندهای متقاطع، تغییر بارهای الکتریکی و افزایش تمایل به تجزیه شدن، می شود.

1-4-1-9-2-آسیب اکسیداتیو به DNA :

اکسیژن فعال و ترکیباتی که رادیکال آزاد اکسیژن تولید می کنند؛ به عنوان مثال پرتوهای یونیزه کننده، سبب ایجاد آسیب های متعددی در DNAنظیر deletion، جهش ها و دیگر اثرات ژنتیکی کشنده، می شوند.

بخش باز آلی و بخش قند در DNA، مستعد اکسیداسیون، تخریب، شکست تک رشته ی DNA و پیوند متقاطع به پروتئین ها است.

1-4-1-10-رادیکال های آزاد و بیماری ها:

رادیکال های آزاد، باعث تعدادی از بیماری های تحلیل برنده می شوند؛ که تغییرات وسیعی درعملکردهای فیزیولوژیکی دارند مانند آترواسکلروزیز، دیابت، آسیب ایسکمی/ رپرفیوژن، بیماری های التهابی ( آرتریت روماتوئید، سندروم روده ی ملتهب)، پانکراتیت، سرطان، بیماری های عصب شناسی، افزایش فشار خون.

1-4-1-11-مکانیسم شکل گیری رادیکال های آزاد:

رادیکال های آزاد از سه راه به وجود می آیند:

1-به وسیله تقسیم همولیتیک پیوند کوالانسی مولکول های نرمال، به طوری که با هر بخش، یکی از جفت الکترون ها همراه شود.

2- به وسیله ی از دست دادن یک الکترون از مولکول نرمال

3- به وسیله ی اضافه شدن یک الکترون تک، به مولکول نرمال

یک رادیکال، الکترون منفرد خود را به مولکول دیگر می دهد. یا ممکن است رادیکال آزاد، از مولکول دیگر، یک الکترون بگیرد.(3)

1-4-2:آنتی اکسیدان:

آنتی اکسیدان ها، مهار کننده های فرآیند اکسیداسیون هستند. جزء آنتی اکسیدان ترکیبات گیاهی، نقش به دام اندازنده ی رادیکال آزاد را دارد و رادیکال ها را به گونه های کمتر فعال، تبدیل می کند. آنتی اکسیدان های متنوعی در منابع رژیم غذایی مثلاً میوه ها، سبزیجات و چای یافت می شوند. (3)

1-4-2-1- دسته بندی آنتی اکسیدان ها: (از منظری دیگر)

الف) آنتی اکسیدان های طبیعی:

ب) آنتی اکسیدان های سنتتیک:

الف) آنتی اکسیدان های طبیعی:

آنزیم ها:

مثلاً سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز

تولید گونه های فعال اکسیژن را به وسیله ی حذف ترکیبات اکسیدان بالقوه یا به وسیله ی تبدیل ROS به ترکیبات نسبتاً پایدار، تقلیل می دهند.

1-4-2-2- شیوه ی فعالیت آنتی اکسیدان ها:

به طور کلی آنتی اکسیدان ها از طریق مسیرهای زیر فعالیت می کنند.

1- واکنش گسستن زنجیره: به عنوان مثال آلفا-توکرفرول که در فاز لیپیدی برای به دام انداختن رادیکال های آزاد فعالیت می کند.

2- توسط کم کردن غلظت گونه های فعال اکسیژن به عنوان مثال گلوتاتیون.(3)

بطور خلاصه آنتی اکسیدان، مولکولی است که قادر به مهار اکسیداسیون دیگر مولکول ها باشد (2) . اکسیداسیون یک واکنش شیمیایی است که الکترون ها را از یک ماده، به ترکیب اکسید کننده منتقل می کند. واکنش اکسیداسیون، می تواند رادیکال آزاد، تولید کند و این رادیکال ها می توانند یک واکنش زنجیره ای را شروع کنند؛ که به سلول ها آسیب وارد شود. آنتی اکسیدان ها؛ در طی واکنش های زنجیره ای نهایتاً باعث حذف رادیکال های آزاد میانجی خواهند شد و واکنش های اکسیداسیون دیگر را مهار می کنند. آنتی اکسیدان ها؛ این وظیفه را به وسیله ی اکسید شدن خودشان انجام می دهند. بنابر این آنتی اکسیدان ها، اغلب، ترکیبات احیاءکننده هستند مانند تیول،آسکوربیک اسید، پلی فنل ها.

گرچه واکنش های اکسیداسیون، برای ادامه ی حیات، نقش اساسی دارند، می توانند مضر هم باشند. بنابراین گیاهان و جانوران، سیستم پیچیده ای از انواع آنتی اکسیدان ها را حفظ کرده اند به عنوان مثال گلوتاتیون، ویتامین C،ویتامین E و آنزیم هایی مانند کاتالاز، سوپر اکسید دیسموتاز و پراکسیدازهای مختلف.

 

سطح پایین آنتی اکسیدان ها، یا مهار آنزیم های آنتی اکسیدان، باعث ایجاد استرس اکسیداتیو می شود. به طوری که استرس اکسیداتیو،می تواند یک عامل مهم خیلی از بیماری های انسانی باشد.

امروزه استفاده از آنتی اکسیدان ها در فارماکولوژی با جدیت انجام می شود؛ مخصوصاً به عنوان درمان سکته و بیماری های نورو دژنریتیو.

اکسیژن یک مولکول واکنش پذیر است که توسط تولید گونه های فعال اکسیژن به موجودات زنده، آسیب وارد می کند. در نتیجه موجودات زنده شامل شبکه ی پیچیده ای از متابولیت های آنتی اکسیدان و آنزیم های آنتی اکسیدان هستند که به کمک یکدیگر از آسیب اکسیداتیو به محتویات سلول از قبیل DNA، پروتئین ها، جلوگیری می کنند.

گونه های فعال اکسیژن تولید شده در سلول، شامل پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و هیپوکلروس اسید، و رادیکال های آزاد از قبیل رادیکال هیدروکسیل (OH) و آنیون سوپراکسید (O₂) است. این گونه ها از پراکسید هیدروژن (H₂O₂)در طی واکنش های احیایی متال کاتالایزد به عنوان مثال واکنش فنتون تولید می شوند.

این اکسیدان ها، می توانند توسط شروع واکنش های زنجیره ای شیمیایی به سلول آسیب وارد کند. به عنوان مثال پراکسیداسیون چربی و یا اکسید کردن DNA و پروتئین ها.

آسیب به DNA، می تواند باعث جهش و گاهی سرطان شود؛ البته اگر توسط مکانیسم های ترمیم DNA، اصلاح نشود.

آسیب به پروتئین ها، باعث مهار آنزیم ها، و دناتوراسیون پروتئین ها یا تجزیه ی آن ها می شود.

استفاده از اکسیژن، به عنوان بخشی از فرآیند تولید انرژی متابولیک، باعث تولید رادیکال آزاد اکسیژن می شود.

در این فرآیند آنیون سوپراکسید، به عنوان محصول جانبی در چندین مرحله از زنجیره ی انتقال الکترون، تولید می شود.

 

1-4-2-3- انواع آنتی اکسیدانها(از منظر حلالیت در آب):

آنتی اکسیدان ها به دو دسته هیدرو فوبیک و هیدروفیلیک تقسیم می شوند.

به طور کلی آنتی اکسیدان های محلول در آب در سیتوزول سلول و پلاسمای خون، با اکسیدان ها واکنش می دهند. در حالیکه آنتی اکسیدان های محلول در چربی، غشاء های سلول را از پراکسیداسیون چربی ها، محافظت می کنند. این ترکیبات می توانند در بدن ساخته شوند یا از رژیم غذایی اخذ شوند.

آنتی اکسیدان های مختلف در پهنه ی وسیعی از غلظت ها در مایعات بدن و بافت ها یافت می شوند. مثال برای غلظت کم، گلوتاتیون و یوبی کويینون است؛ که اغلب درون سلول حضور دارند. در حالی که آنتی اکسیدانت های دیگر مانند اسید اوریک، وسعت غلظتی بیشتری دارند.

اثرات متقابل بین این آنتی اکسیدان های مختلف، موارد پیچیده ای است و در ارتباط با متابولیت های گوناگون و سیستم های آنزیمی دارای اثر هم افزایی و اثر وابسته به دیگری می باشد. بنابراین ممکن است فعالیت یک آنتی اکسیدان، وابسته به عملکرد مناسب عضو دیگر سیستم آنتی اکسیدانی باشد. میزان اثر حمایتی هر یک از آنتی اکسیدان ها، وابسته به غلظت آن است.

آسکوربیک اسید(ویتامین c )، یک منو ساکارید کاتالیزگر واکنش های اکسیداسیون – احیاء موجود در جانوران و گیاهان است.

آسکوربیک اسید، برای تبدیل پرو کلاژن به کلاژن، به وسیله ی اکسید کردن پرولین به هیدروکسی پرولین، لازم است. در سلول های دیگر، آسکوربیک اسید، به شکل احیاء شده اش توسط واکنش با گلوتاتیون، نگهداری می شود که می تواند توسط آنزیم های پروتئین دی سولفید ایزومراز و گلوتاردوکسین ها کاتالیز می شود.

گلوتاتیون، یک تری پپتید دارای سیستئین است که در اغلب اشکال زندگی بی هوازی، یافت می شود. گلوتاتیون، در رژیم غذایی مورد نیاز نیست؛ زیرا توسط اسید آمینه های سازنده اش در بدن سنتز می شود. گلوتاتیون خصوصیات آنتی اکسیدانی دارد. بنابراین گروه تیول در بخش سیستئین اش عامل احیاءکننده است و می تواند به صورت متناوب، اکسید و احیاء شود. در سلول ها گلوتاتیون به وسیله ی آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز، به فرم احیاء شده اش در می آید.

1-4-2-4- استرس اکسیداتیو در بیماری ها:

عقیده بر این است که استرس اکسیداتیو در توسعه ی محدوده ی وسیعی از بیماری ها مانند آلزایمر، پارکینسون، دیابت، آرتریت روماتوئید، تحلیل نورون ها در بیماری های نورون های حرکتی، شرکت می کند.

1-4-2-5- جلوگیری از بیماری ها:

افرادی که میوه و سبزیجات مصرف می کنند، خطر ابتلای کمتری به بیماری های قلبی و برخی از بیماری های نورولوژیکی دارند.(2)

1-4-2-6- آنتی اکسیدان های پلی فنل:

آنتی اکسیدان های پلی فنل نوعی از آنتی اکسیدان های دارای زیرساخت پلی فنل هستند. تعداد بیش از چهار هزار نوع مجزا، ترکیب پلی فنل وجود دارد. (4)

1-4-2-7- تئوری بیوشیمیایی:

آنتی اکسیدان های پلی فنلی قادرند؛ رادیکال های آزاد را به دام بیندازند و واکنش های شلات کننده فلزات را تنظیم کنند. گونه های فعال اکسیژن به عنوان مثال اکسیژن منفرد، پر اکسی نیتریت و پراکسید هیدروژن، باید دائماً از محیط سلول ها حذف شوند؛ تا عملکردهای صحیح متابولیکی رخ دهد. غلظت نزولی گونه های فعال اکسیژن، مزایای متعددی دارد که وابسته به سیستم های انتقال یون؛ و به شدت تحت تأثیر سیگنال های احیایی است.

1-4-2-8- اثرات زیستی بالقوه پلی فنل ها:

مصرف پلی فنل ها در رژیم غذایی می تواند باعث اثراتی مفید در گونه های جانوری عالی شود. مانند اثرات کاهش التهاب به عنوان مثال بیماری های عروق کرونر قلب (4)

1-4-3- سلول های PC12:

از فئوکروموسايتومای آدرنال موش صحرایی بدست آمده اند؛ مدل مناسبی در مطالعات سيستم عصبي می باشند. اين سلول به عنوان يك مدل عصبي مناسب در مطالعات علوم اعصاب، انتقال سيگنال‌ها و مرگ سلولي در نورون‌ها شناخته شده است.

1-4-4- تست سلولی MTT:

در اين روش از رنگ تترازوليوم استفاده مي‌شود. در اين تست با سنجش عملكرد آنزيم‌هاي ميتوكندري بر روي يك ماده رنگي، مي‌توان از زنده بودن يا مرگ سلول‌ها بر اثر تيمار مربوطه، آگاهي يافت. ميتوكندري‌ها اندامك‌هاي سلولهاي يوكاريوت هستند؛ كه اصلي‌ترين توليدكننده‌ي ATP محسوب مي‌گردند. محيط هر ميتوكندري از يك غشاء خارجي و يك غشاء داخلي تشكيل شده است كه فضاي درون ميتوكندري را به دو ناحيه ماتريكس و فضاي حد واسط (بينابيني) تقسيم مي‌كند. ميتوكندري به دليل داشتن آنزيم‌هاي گوناگون قادر به متابوليزه نمودن طيف وسيعي از مواد مي‌باشد. برخي از آنزيم‌هاي موجود در غشاي داخلي و خارجي ميتوكندري قادر به تبديل تركيب تترازوليوم زرد رنگ (MTT) به بلورهاي بنفش رنگ فورمازان مي‌باشند . از آنجا كه با مرگ سلول، ميتوكندري ها نيز از بين مي‌روند، بنابراين حضور ميتوكندري‌هاي سالم كه قادر به متابوليزه نمودن MTT مي‌باشند، معيار مناسبي براي بررسي سلولهاي زنده مي‌باشد .

تترازوليوم ماده‌اي زرد رنگ و محلول در آب است كه توسط ميتوكندري سلولهاي زنده، احياء مي‌شود و تركيبي بنفش رنگ، به نام فورمازان ايجاد مي‌شود. مقدار فورمازان توليد شده را مي‌توان پس از حل نمودن بلورهاي بنفش رنگ در حلال مناسبي همچون DMSO به كمك اسپكتروفتومتري اندازه‌گيري نمود.

بطور خلاصه، در این تست توانایی متابولیزه کردن رنگ تترازولیوم در میتوکندری سلولهای سالم و دستخوش تغییر، بکمک میزان جدب نوری بررسی می شود.اساس اين آزمون بر مبناي توانايي سلولهاي زنده مانده، براي تبديل نمك تترازوليوم محلول، به رسوب فورمازان است. كريستالهاي فورمازان در DMSO حل شده و دانسيته نوري، از طريق اسپكتروفتومتر اندازه‌گيري مي‌شود.

لازم به تاکید است که آپوپتوز توسط دو مسیر خارجی و یا داخلی، فعال می گردد. مختصرا ميتوان اشاره كرد؛ هر دو مسیر در نهایت، منجر به فعال شدن یک سری آنزیم های سیستئین پروتئاز به نام کاسپاز (caspase)، در سلول می گردند. که فعال شدن آنها به نوبه خود، سبب ایجاد تغییرات مورفولوژیک آپپتوز شامل متراكم شدن كروماتين، تکه تکه شدن DNA، تشکیل اجسام آپوپتوتیک می گردند. در حالی که مسير خارجي با اتصال ليگاند ها به رسپتورهاي مرگ ((DR ،در سطح سلول آغاز مي شود. مسیر داخلی نيازمند مداخله ميتوكندري می باشد. در مسیر داخلی، عوامل متعددي سبب افزایش نفوذ پذیری میتوکندری و آزاد شدن فاكتورهاي آپپتوژنيك مانند سيتوکروم C می گردند که در نتیجه آن کاسپازها، فعال می شوند.

مورفولوژي مرگ آپپتوزي شامل تراكم كروماتين، قطعه قطعه شدنهسته، غليظ شدن سيتوپلاسم و تجزيه و محصور شدن با غشاء پلاسمايي و ايجاد اجسام آپپتوتيك ميباشد. اين نوع مرگ از طريق فرآيندي به نام مرگ برنامه ريزي شده سلول Programmed cell death (PCD) يا آپپتوز صورت مي گيرد.

1-4-5-1- مراحل مرگ برنامه ريزي شده سلول:

1-4-5-1-1- مرحله فعال شدن :Activationکه ‌مسيرهاي انتقال پيام متعدد با واسطه پيام هاي گوناگون (مرگ زا) مركز كنترل ماشين مرگ سلولي را هدف قرار داده و آن را فعال مي سازد.

1-4-5-1-2- مرحله پيشرفت :Excutionكه بدنبال فعال شدن ماشين مرگ سلولي ايجاد مي شود در اين مرحله عوامل فعال شده در مرحله قبل بر اهداف متعدد داخل سلول عمل مي كند.

1-4-5-1-3- مرحلهانهدام :Destruction‌ كه آخرين مرحله بوده و با مرگ سلول همراه است.در اين مرحله آنزيم هاي هيدروليتيك، مانند پروتئاز ها و نوكلئازها فعال مي شوند و تغييرات مورفولوژيك آپپتوز آشكار مي گردد.

1-4-5-2-تفاوت آپپتوزونكروز:

آپپتوز و نكروز از نظر بيوشيميايي و ساختماني از يكديگر متفاوتند و به همين دليل آنها را در دو طبقه بندي جداگانه در مرگ هاي سلولي قرار مي دهند. نكروز يا مرگ آسيب شناختي سلول، هنگامي رخ ميدهد كه آسيب هاي فيزيكي و شيميايي يا اسمزي به سلول وارد آيد و يا برخي از فعاليت هاي ضروري سلول توسط سموم مختلف، متوقف شود. دراين حال سلول حجيم گرديده و غشاء پلاسمايي سلول پاره شده و محتويات آن بيرون مي ريزد. در اثر بيرون ريختن محتويات سلول، پاسخ التهابي ايجاد مي شود. نكروز، معمولا باعث القاء آسيب ثانويه سلول در بافت هاي اطراف مي گردد. اما در آپپتوز كه به آن مرگ فيزيولوژيك مي گوييم؛حجم سلول كوچك شده، چگالي آن افزايش مي يابد، كروماتين، متراكم مي گردد و آنزيمهاي خاصي فعال شده و شروع به تجزيه پروتئين ها و DNA مي كنند. اما غشاء سلول پاره نمي شود؛ بلكه سلول بصورت چند گرانول كوچك در آمده؛ كه توسط سلول هاي اطراف، خورده مي شود . و بدنبال آن پاسخ التهابي ديده نمي شود. در حقيقت آپپتوز يك برنامه خود كشي دروني است كه فعال شده و سلول را مي كشد.

1-4-5-3-تغييراتريختشناختيوزيستشيمياييسلول:

1-4-5-3-1- تغييرات هستهوقطعه قطعه شدن مولكول DNA:

متراكم شدن كروماتين و شكست غشاي هسته از جمله رخدادهايي هستند كه در آپپتوز رخ مي دهند. همين وقايع در خلال ميتوز، از طريق محلول شدن لامين هاي هسته اي و پس از فسفريلاسيون آن توسط P34 ^cdc2صورت مي پذيرد. لامين ها با بخشي از فيلامنت هاي حد واسط، در تماس مي باشند؛ که نقش آنها ايجاد اسكلت هسته اي و فراهم آوردن چارچوبي براي اتصال كروماتين به غشاي هسته است. از هم گسيختگي لامين در آپپتوز، بر خلاف ميتوز با پروتئوليز مي باشد و به ظاهر غير قابل برگشت است.
قطعه قطعه شدن DNA(DNA Fragmentationn)، از جمله رخدادهاي ديگري است كه در اپپتوز رخ مي دهد و وجه مشخصه بيوشيميائي آپپتوز مي باشد. اين فرايند که برگشت ناپذير است؛ نتيجه فعاليت آنزيم اندونوکلئاز هسته اي مي باشند. اين آنزيم که وابسته به کلسيم و منیزيم مي باشد، به طور اختصاصي و انتخابي، DNA سلول را در نواحي ای که Linker DNA ناميده مي شوند و بين نوکلئوزوم ها قرار دارند؛ مي شکنند و قطعات مونو و اليگو نوکلئوزومال DNA توليد مي کنند (شکل 2-1).

تصوير1-9:

اين قطعات را كه طول آنها مضربي از طول يك نوكلئوزوم (180 جفت باز) است مي توان به صورت يك نردبان(laddar ) روي ژل الكتروفورز مشاهده كرد. نماي Laddar ويژگي منحصر به فردي است که فقط در مرگ سلولي ناشي از آپپتوز ديده مي شود.

1-4-5-3-2- تغييرات سیتوپلاسمي:

از جمله ويژگي هاي ريخت شناسي آپپتوز، قطعه قطعه شدن سلول به اجسام آپپتوزي است. نوآرايي شبكه ميكروفيلامنت سلول در اوايل اين فرآيند رخ مي دهد. عوامل تخريب كننده ميكروتوبول مانند كلشي سين

( Colchicine )، وين بلاستين ( Vinblastine ) و مانند آن، مي توانند آپپتوز را القا كنند. بنابر اين تخريب شبكه ميكروتوبول، احتمالاً از حوادث اوليه آپپتوز مي باشد.

بيان ترانس گلوتاميتاز نوع II يا نوع بافتي در اوايل آپپتوز، افزايش مي يابد. اين آنزيم با ايجاد پيوندهاي عرضي در پروتئين هاي درون سلول، موجب تثبيت سيتوپلاسم و جلوگيري از تراوش عناصر سلولي به بيرون و مهار پاسخ التهابي مي شود. اين آنزيم، با تثبيت سيتوپلاسم سلولهاي آپپتوتيك، يك آنزيم كليدي در تشكيل اجسام آپپتوتيك مي باشد.

1-4-5-3-3- تغييرات غشاي سلول:

غشاي سلول تغييرات وسيعي را درطيآپپتوز از خود نشان مي دهد. جدايي سلول از سلولهاي مجاور و سوبسترا در شرايط in vitro و جدايي از ماتريكس خارج سلول در شرايط in vivo، از دست دادن ساختارهاي تخصصي مانند ريز پرزها، ارائه نشانگرهاي خاص روي سطح سلول، براي تسهيل امر شناسايي و فاگوسيتوز اجسام آپپتوزي؛ از جمله تغييراتي است كه غشاي سلول متحمل مي شود. از جمله علايمي كه روي سطح سلول ارايه مي شود، تا فاگوسيت کننده ها راحت تر آن را شناسايي كنند، مي توان CD36، ترومبوسپوندين (thrombospondin)، وجود فسفاتیديل كولين در سطح خارجي غشا و از دست دادن باقيمانده هاي زنجيره سياليك انتهايي از زنجيره قندي گليكو پروتئين ها را نام برد.

1-4-5-4- مسيرهاي خارجي و داخلي در آپپتوز:

جهت انجام فرآيند آپپتوز، دو مسير مستقل كه داراي اهميت بيشتري نيز مي باشند؛ شناسايي شده اند. اين دو مسير در نهايت، باعث فعال شدن آنزيم هاي Caspase ‌مي­شوند و عملا در اين مرحله، همگرا مي شوند.Caspase هاي فعال شده در اثر هردو مسير، باعث شكستن سوبسترايي مي شوند؛ كه سرانجام منجر به مرگ سلول مي گردند.

1-4-5-4- 1- مسير خارجي:

اين مسير با اتصال ليگاند ها به رسپتورهاي مرگ DR در سطح سلول آغاز مي شود. رسپتورهاي مرگ متعلق به خانواده TNF آلفا هستند ومي توان به CD95 (Fas)، TNFR1، TNFR2 و رسپتورهاي مرگ 3،4،5 (DR3, DR4, DR5) اشاره کرد. اتصال ليگاند ها به اين رسپتورها، منجر به فعال شدن caspase 8 شده كه خود،caspase 3 را فعال نموده و ساير Caspase ها نيز فعال مي شوند. سلولهايي كه ژن caspase8‌در آنها حذف شده، به آپپتوز با واسطه Fas و TNF‌ پاسخ نمي دهند و مقاوم هستند.

1-4-5-4- 2-مسير داخلي:

عوامل متعددي از جمله ايسكمي، عوامل توكسيك، استرس اكسيداتيو و ساير محرك ها براي فعال نمودن آپپتوز نيازمند مداخله ميتوكندري هستند. نقش ميتوكندري در آپپتوز، محوري مي باشد. ميتوكندري از طريق آزاد نمودن فاكتورهاي آپپتوژنيك، كه بطور طبيعي در فضاي بين غشايي آن قرار دارند؛ وارد عمل مي شود. القا آپپتوز توسط ميتوكندري، به س